重组分枝杆菌作为免疫治疗剂用于治疗癌症制造技术

本发明专利技术涉及在癌症的治疗中、特别是在实体肿瘤的治疗中用作免疫治疗试剂的重组分枝杆菌。更具体地，本发明专利技术涉及膀胱癌的免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组分枝杆菌作为免疫治疗剂用于治疗癌症本专利技术涉及在癌症治疗中、特别是在实体肿瘤的治疗中用作免疫治疗试剂的重组分枝杆菌细胞。更具体而言，本专利技术涉及膀胱癌的免疫治疗。泌尿道膀胱癌是第5种最常见的癌症。在美国，每年诊断大约75000例新病例，占所有新发癌症的4.5％，并且预计大约有15600例死亡。在德国，每年诊断大约16000个新病例。由于疾病的复发可能在膀胱癌中，所以患者必须经历长期监测。大部分的膀胱癌开始于移行上皮细胞，该细胞构成了膀胱的内衬。随着这些肿瘤的生长，它们可以侵入周围的结缔组织和肌肉。在晚期疾病中，肿瘤扩散至膀胱以外，至附近的淋巴结或盆腔器官，或者转移至更远端的器官，例如肺、肝脏和骨骼。膀胱癌的整体5年生存率为77％，并且在过去的10年中，该生存率尚未明显改变。当通过分期来考虑时，具有局限于膀胱内层的肿瘤的患者的5年相对生存率分别为96％和69％。对于疾病局部扩散至膀胱以外的那些患者而言，上述生存率下降至34％，具有远端转移的患者的生存率降至6％。对于患有非肌层浸润性膀胱癌的患者而言，治疗通常涉及手术除去肿瘤，然后在膀胱内进行化疗，通常为丝裂霉素C(所谓的膀胱内化疗)。在由手术恢复后，具有较低的疾病进展风险的患者可以经历监测或进一步的膀胱内化疗。中度至重度疾病的患者通常接受减毒活菌(卡介苗(BCG))的膀胱内免疫治疗。BCG是首个FDA批准的免疫治疗，其有助于通过刺激靶向细菌和任何膀胱癌细胞的免疫应答而降低膀胱癌复发的风险。但是，发现在一些患者中BCG治疗的有效性低，特别是在重复给予之后。用于肌层浸润性膀胱癌患者的标准治疗包括基于顺铂的化疗，然后手术除去膀胱，或者放疗和联合化疗。复发的膀胱癌可以使用组合治疗方案进行治疗，包括吉西他滨加顺铂或甲氨蝶呤，长春碱，阿霉素加顺铂。在膀胱癌的治疗中，肿瘤复发是主要关注的问题，甚至对于轻度疾病的患者也是如此，需要大量的随访。更好的治疗(例如新型免疫治疗)可能降低复发率并改善膀胱癌患者的生存。表达吞噬溶酶体逃逸结构域(phagolysosomalescapedomain)的重组BCG菌株在WO99/101496中有描述，该文献的内容以引用方式并入本文。吞噬溶酶体逃逸结构域能够通过使吞噬小体的膜穿孔而使得菌株由被感染的宿主细胞的吞噬小体中逃逸。为了提供用于最佳吞噬溶酶体逃逸活性的酸性吞噬小体pH，研发出了一种脲酶缺陷型重组菌株。该菌株在WO2004/094469中公开，该文献的内容以引用方式并入本文。WO2012/085101(该文献的内容以引用方式并入本文)公开了单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的表达膜穿孔李斯特菌溶血素(Hly)的重组BCG菌株，并且在临床前模型中，与亲代BCG相比，脲酶C的缺乏会诱导更优异的对抗结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis(Mtb))的产气攻击的保护。此外，已经显示重组的和亲代的菌株均诱导显著的Th1免疫应答，而仅重组BCG菌株还激发强烈的Th17应答。在近来的研究中，发现在动物模型中，重组脲酶缺陷型且表达李斯特菌溶血素的重组BCG菌株与亲代BCG相比，会诱导优异的免疫应答。本专利技术的主题是用作免疫治疗剂、用于实体肿瘤治疗的重组分枝杆菌细胞，其包含编码融合多肽的重组核酸分子，其中所述的融合多肽包含：(a)能够激发免疫应答的结构域；以及(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。本专利技术的另一个方面涉及在有此需要的受试对象中对实体肿瘤进行免疫治疗的方法，其包括向所述的受试对象给予重组的分枝杆菌细胞，所述的重组分枝杆菌细胞包含编码融合多肽的重组核酸分子，其中所述的融合多肽包含：(a)能够激发免疫应答的结构域；以及(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。根据本专利技术，发现将重组BCG细胞膀胱灌注(vesicularinstillation)至大鼠的膀胱中后惊人地导致了淋巴细胞对泌尿膀胱组织的浸润增加，特别是CD4-和CD8-阳性淋巴细胞，导致高发生率的局灶性和/或多局灶性淋巴细胞浸润。与其相反，使用标准的BCG处理的动物的泌尿膀胱组织显示仅在单细胞浸润水平(弥漫性浸润)的CD4-和CD8-阳性淋巴细胞。此外，给予重组BCG细胞不会产生任何安全问题。近来实施了I/II期临床试验，其对在标准BCG治疗后复发的非肌层浸润性膀胱癌人类患者中膀胱内灌注重组BCG的安全性和功效进行评估。因此，本专利技术还涉及上文所述的重组分枝杆菌细胞，其在实体肿瘤的治疗中用作免疫治疗试剂从而获得局灶性和/或多局灶性淋巴细胞浸润，例如在给予位点具有CD4和CD8T细胞。本专利技术的重组分枝杆菌细胞特别适用于人类医疗。免疫治疗试剂为活的重组分枝杆菌细胞，其包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述的融合多肽包含(a)能够激发免疫应答的结构域；以及(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。能够激发免疫应答的结构域优选为得自病原体或其免疫原性片段的免疫原性肽或多肽。分枝杆菌细胞优选为牛分枝杆菌(M.bovis)细胞，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细胞，特别是减毒结核分枝杆菌细胞或其他的分枝杆菌，例如M.microti,耻垢分枝杆菌(M.smegmatis),M.canettii,M.marinum或偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。更优选地，所述的细胞为减毒的重组牛分枝杆菌(BCG)细胞，特别是牛分枝杆菌BCG细胞，特别是得自丹麦株布拉格亚型的重组牛分枝杆菌BCG细胞(Broschetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104(2007),5396-5601)。在一个特别优选的实施方案中，分枝杆菌细胞为重组的脲酶缺陷型的。在一个特别优选的实施方案中，分枝杆菌的ureC序列被灭活(ΔUrec)，例如通过构建包含ureC基因的自杀载体，其中所述的ureC基因被选择性标记基因(例如潮霉素基因)破坏；使用所述的载体转化靶细胞；以及筛选具有脲酶阴性表型的选择性标记阳性细胞。在一个甚至更优选的实施方案中，选择性标记基因(例如潮霉素基因)随后被灭活。在该实施方案中，所述的细胞为不含选择性标记的重组分枝杆菌细胞。更优选地，所述的细胞为不含选择性标记的重组BCG丹麦株布拉格亚型，其表征为重组BCGΔUrec::Hly+。能够激发免疫应答的结构域优选地选自得自牛分枝杆菌、结核分枝杆菌或M.leprae的免疫原性肽或多肽，或者它们的免疫原性片段，其长度为至少6个、优选为至少8个氨基酸，更优选为至少9个氨基酸，例如多达20个氨基酸。合适的抗原的具体实例为得自结核分枝杆菌的Ag85B(p30)，得自牛分枝杆菌BCG的Ag85B(α-抗原)，得自结核分枝杆菌的Ag85A，得自结核分枝杆菌的ESAT-6，以及它们的片段。在其他的实施方案中，能够激发免疫应答的结构域选自非分枝杆菌多肽。更优选地，所述免疫原性结构域衍生自抗原Ag85B。最优选地，免疫原性结构域包含SEQIDNo.2中aa.41至aa.51的序列。重组核酸分子进一步包含吞噬溶酶体逃逸结构域，即提供融合多肽由吞噬溶酶体逃逸至哺乳动物细胞的细胞溶质中的多肽结构域。优选地，吞噬溶酶体逃逸结构域为李斯特菌吞噬溶酶体逃逸结构域，其在US5,733,151中描述，所述的文献以引用方式并入本文。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在膀胱癌的治疗中用作免疫治疗剂的重组牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)细胞，其包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述的融合多肽包含：(a)能够激发免疫应答的结构域；以及(b)李斯特菌吞噬溶酶体逃逸结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.04 EP 15166206.1;2015.12.23 US 62/387,4071.一种在膀胱癌的治疗中用作免疫治疗剂的重组牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)细胞，其包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述的融合多肽包含：(a)能够激发免疫应答的结构域；以及(b)李斯特菌吞噬溶酶体逃逸结构域。2.权利要求1所述的细胞，其为脲酶缺陷型细胞。3.权利要求1或2所述的细胞，其为得自丹麦株布拉格亚型的重组牛分枝杆菌BCG细胞。4.权利要求1-3中任意一项所述的细胞，其中所述的能够激发免疫应答的结构域选自得自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的免疫原性肽或者多肽。5.权利要求1-4中任意一项所述的细胞，其中所述的重组核酸分子不包含任何功能性选择标志。6.权利要求1-5中任意一项所述的细胞，其中所述的融合多肽包含：(a)能够激发免疫应答的结构域，其包含SEQIDNo.2中aa.41至aa.51的氨基酸序列；以及(b)由选自以下的核酸分子编码的李斯特菌吞噬溶酶体逃逸结构域：(i)包含SEQIDNo.1中所示的核苷酸211-1722的核苷酸序列；(ii)与(i)的序列编码相同氨基酸序列的核苷酸序列；以及(iii)在严谨条件下与(i)或(ii)的序列杂交的核苷酸序列。7.权利要求1-6中任意一项所述的细胞，其中所述的膀胱癌为非侵入性膀胱癌，特别是原位癌(Tcis)；非侵入性乳头状癌(Ta)；或浸润上皮下结缔组织的肿瘤(T1)。8.权利要求1-7中任意一项所述的细胞，其中所述的治疗包括向肿瘤位点局部给予所述的免疫治疗试剂，特别是在手术后。9.权利要求6-8中任意一项所述的细胞，其中所述的治疗剂是通过膀胱灌注...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·格罗德，
申请(专利权)人：疫苗项目管理有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE