细粒棘球蚴重组BCG疫苗及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种细粒棘球蚴重组BCG疫苗的制备；本疫苗具有热稳定性好，便于运输和保存，单次免疫就可诱导高效价的针对“靶抗原”的抗体，免疫力持久，免疫次数少，简化了免疫程序，增强了针对细粒棘球蚴病的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种细粒棘球绦虫重组BCG疫苗，用于预防控制动物细粒棘球蝴病，同时还提供了该疫苗的制备方法，属于疫苗制备

技术介绍
棘球蝴病(cystic echinococcosis, CE)是一种严重危害人们身体健康的人畜共患寄生虫病，已成为农牧民因病致贫，因病返贫的主要因素之一。目前对包虫病患者进行包虫囊摘除术是首选的治疗方法。但手术对人体带来的损伤比较大且有可能复发，化疗药物可产生一些严重的不良反应。因此，需要研究更有效的解决方法，而疫苗预防是防治其流行的有效措施。预防细粒棘球蝴病的疫苗经历了多肽疫苗，亚单位疫苗，DNA疫苗等多种探索，随着生物技术的发展，重组活疫苗的制备得到了一种新的方法。基因重组卡介苗(rBCG)是借助基因工程技术，将外源基因导入BCG中构建而成的多价疫苗(rBCG)，可诱导长期的体液免疫和细胞免疫，近几年的研究结果已显示出rBCG具有非常好的应用前景，有望发展成为预防疾病的一种实际可用的新型疫苗。本专利技术小组曹春宝等从细粒棘球蝴中克隆了 egGlY162抗原基因。结果显示，egGlY162基因不论是在基因序列上，还是在氨基酸序列及蛋白结构上均与国外研究者已研发出的用于终末宿主保护的候选疫苗emY162有高度的相似性，很可能也是终末宿主的保护性抗原。虽然使用BCG构建多价疫苗在本领域已经熟知，但影响疫苗效率的因素有很多，如何研发出预防棘球蝴病的 高效疫苗仍然是亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种细粒棘球绦虫重组BCG疫苗，为穿梭表达载体细粒棘球绦虫重组BCG疫苗，具有热稳定性好，便于运输和保存，免疫力持久，免疫次数少，免疫程序简化，增强了针对细粒棘球蝴病的免疫效果。生产成本少，便于生产等特点。本专利技术还公开了细粒棘球绦虫重组BCG疫苗的制备方法，以利于工业化生产。本专利技术重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的解决方案如下首先获得细粒棘球绦虫保护性抗原基因，进行TA克隆，将测序正确的目的片段酶切回收，再与经同样酶切的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV361相连，构建重组表达载体，将重组表达载体电转化入BCG,经抗性筛选和PCR扩增筛选得到阳性抗细粒棘球绦虫重组BCG克隆。本专利技术所提供的重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的制备方法，其包括如下步骤(I)合成上游和下游引物上游引物5'-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3'；下游引物5'-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'；(2)目的基因egGlY162的PCR扩增以细粒棘球蝴cDNA为模板，采用上述的上下游引物，进行PCR扩增，扩增体系为灭菌水 16 μ 1，质粒 2μ 1，EcoRI O. 5 μ 1，Hind III 0. 5μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 扩增体系；Touchdown PCR 反应条件95°C 4 min ；95°C 30s，65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 个循环；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 个循环；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，将 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小为360bp的目的条带；(3)目的片段egGlY162与载体PMV361的连接egGlY162扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后先与PMD19-T载体连接，利用α互补原则筛选阳性克隆并进行PCR扩增鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，将经上述鉴定正确的阳性克隆扩增后提取egGlY162-PMD19质粒，将该质粒经EcoR1、Hind III限制性内切酶酶切，凝胶回收目的片段后与同样用EcoRI和Hind III进行双酶切的pMV361质粒胶回收产物，按3 :1的摩尔比(目的片段载体)在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接体系为buffer 缓冲液 I μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 载体 I μ I，T4DNA 连接酶 I μ1，*10μ1的连接体系，16°C，连接过夜。转化入E. coli DH5 α感受态细胞后，利用PMV361质粒所携带的卡那霉素抗性筛选egGlY162-PMV361重组子，对阳性克隆进行PCR扩增鉴定和EcoRI和Hind III双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为egGlY162-PMV361 ；(4)重组egGlY162_PMV361载体的电转化将_80°C保存的BCG菌株复苏后接种于含10% OADC的7H9液体培养基，180r /min，37°C，震荡培养至对数生长期，即培养液变混浊，沙样生长后用于感受态细胞的制备。取在7H9液体培养基上 生长良好的BCG培养物，37°C继续震荡培养10天，4°C，5000r/min离心IOmin收集菌体，以灭菌10%甘油洗涤4次，最后一次用适量的10%甘油重悬菌体，即得到BCG感受态细胞。分别将egGlY162-PMV361质粒及空质粒pMV361经电穿孔法分别转化入BCG感受态细胞中，具体电转化条件为电容25Uf，电阻1000Ω，场强18X105V/ m，转化时间为5 ms，转化次数为3 ;放电结束后将100 μ L菌液立即转移入I mL 7H9液体培养液中，37°C震荡培养过夜(>24h)。取培养过夜的转化后菌液800r/min室温离心lOmin，取沉淀100 μ L均匀涂布于含OADC和30 μ g/ml卡那霉素的7H10固体培养基表面，37°C培养3-4周，培养基表面见转化后菌落生长。从7H10固体培养基平板表面挑取BCG重组子，接种于罕OADC的7H9液体培养基中，37°C，培养至对数生长期，取菌液进行PCR扩增鉴定证实为阳性克隆后，分别命名为egGlY162-PMV361-rBCG及PMV361- rBCG ；(5)重组 egGlY162-PMV361-rBCG 的诱导表达将经PCR扩增鉴定证实含有egGlY162-PMV361质粒的rBCG阳性克隆接种在含30 μ g/ml卡那霉素的7H9液体培养基中，37°C，180r/min振摇培养至对数生长期(需3w左右)，进行45°C热诱导45min，离心收集菌体；加入Iml预冷的磷酸盐缓冲液重悬菌泥后超声粉碎，再加入等体积2XSDS-PAGE上样缓冲液，10(TC煮沸5min，冰浴5min，4°C，12000rpm离心 5min ;取 10 μ I 上清进行 SDS-PAGE 分析，最终获得的 egGlY162_PMV361_rBCG表达的融合抗原，其分子量约为71KD。 使用穿梭表达载体细粒棘球绦虫重组BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，不同程度的提高了小鼠的免疫水平。具体表现为在使用重组BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠后，小鼠体内的特异性抗体水平、细胞因子等免疫指标均随着免疫时间和次数的增加而升高，与BCG组合空白对照组相比差异有统计学意义(P〈0. 05);免疫后进行攻虫实验显示，经重组BCG疫苗egGlY162-PMV361-rBCG免疫小鼠体内的囊泡大体变化与空白对照组相比，囊数量减少，体积变小，部分囊表面混浊，部分囊壁塌陷，游离于腹腔，或附着于肠系膜或肝表面。囊湿重抑制率为68本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的制备方法，其包括如下步骤：（1）合成上游和下游引物：上游引物：5′?CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT?3′；下游引物：5′?CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA?3′；（2）目的基因egG1Y162的PCR扩增：以细粒棘球蚴cDNA为模板，采用上述的上下游引物，进行PCR扩增，扩增体系为：灭菌水16μl，质粒2μl，EcoRI?0.5μl，HindⅢ?0.5μl，mix?20μl，共40μl扩增体系；Touchdown?PCR反应条件：95℃?4?min；95℃?30s，65℃?30s?降1℃，72℃?2min?共11个循环；95℃?30s，50℃?30s，75℃?2min?共25个循环；最后72℃?延伸，7min，末次4℃，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小为360bp的目的条带；（3）目的片段egG1Y162与载体PMV361的连接：egG1Y162扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后先与PMD19?T载体连接，利用α互补原则筛选阳性克隆并进行PCR扩增鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，将经上述鉴定正确的阳性克隆扩增后提取egG1Y162?PMD19质粒，将该质粒经EcoRI、HindⅢ?限制性内切酶酶切，凝胶回收目的片段后与同样用EcoRI和HindⅢ进行双酶切的pMV361质粒胶回收产物，按3∶1的摩尔比(目的片段∶载体)在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接体系为：buffer缓冲液1?μl，目的片段7?μl，PMV361载体1?μl?，T4?DNA连接酶1?μl，共10μl的连接体系，16℃，连接过夜。转化入E.coli?DH5α感受态细胞后，利用PMV361质粒所携带的卡那霉素抗性筛选egG1Y162?PMV361重组子，对阳性克隆进行PCR扩增鉴定和EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为egG1Y162?PMV361；（4）重组egG1Y162?PMV361载体的电转化将?80℃保存的BCG菌株复苏后接种于含10%?OADC的7H9液体培养基，?180r／min?，37℃?，震荡培养至对数生长期，即培养液变混浊,?沙样生长后用于感受态细胞的制备。取在7H9液体培养基上生长良好的BCG培养物，?37℃继续震荡培养10天，4℃，5000?r/min离心10min?收集菌体，以灭菌10%甘油洗涤4次，最后一次用适量的10%甘油重悬菌体，即得到BCG感受态细胞。分别将egG1Y162?PMV361质粒及空质粒pMV361经电穿孔法分别转化入BCG感受 态细胞中，具体电转化条件为：电容25Uf，电阻1000Ω，场强18×105V/?m?，转化时间为5?ms，转化次数为3；放电结束后将100μL菌液立即转移入1?mL?7H9液体培养液中，37℃震荡培养过夜（>24h）。取培养过夜的转化后菌液800r/min室温离心10min，取沉淀100μL均匀涂布于含OADC和30μg/ml卡那霉素的7H10固体培养基表面，?37℃培养3?4周，培养基表面见转化后菌落生长。从7H10固体培养基平板表面挑取BCG重组子，接种于罕OADC的7H9液体培养基中，?37℃?，培养至对数生长期，取菌液进行PCR扩增鉴定证实为阳性克隆后，分别命名为egG1Y162?PMV361?rBCG及PMV361??rBCG；（5）重组egG1Y162?PMV361?rBCG的诱导表达将经PCR扩增鉴定证实含有egG1Y162?PMV361质粒的rBCG阳性克隆接种在含30μg/ml?卡那霉素的7H9液体培养基中，37℃，180r/min振摇培养至对数生长期(需3w左右)，进行45℃热诱导45min，离心收集菌体；加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液重悬菌泥后超声粉碎，再加入等体积2×SDS?PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，冰浴5min，4℃，12000rpm离心5min；取10μl上清进行SDS?PAGE分析，最终获得的egG1Y162?PMV361?rBCG表达的融合抗原，其分子量约为71KD。...

【技术特征摘要】
1.重组细粒棘球绦虫BCG疫苗的制备方法，其包括如下步骤(1)合成上游和下游引物上游引物5' -CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3'；下游引物5' -CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3'；(2)目的基因egGlY162的PCR扩增以细粒棘球蝴cDNA为模板，采用上述的上下游引物，进行PCR扩增，扩增体系为灭菌水 16 μ 1，质粒 2 μ 1，EcoRI O. 5 μ I, HindIII O. 5 μ I, mix 20 μ 1，共 40 μ I 扩增体系; Touchdown PCR 反应条件95°C 4 min ；95°C 30s, 65°C 30s 降 1°C，72°C 2min 共 11 个循环；95°C 30s, 50°C 30s, 75°C 2min 共 25 个循环；最后 72°C 延伸，7min，末次 4°C，将 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小为360bp的目的条带；(3)目的片段egGlY162与载体PMV361的连接egGlY162扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后先与PMD19-T载体连接，利用α互补原则筛选阳性克隆并进行PCR扩增鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，将经上述鉴定正确的阳性克隆扩增后提取egGlY162-PMD19质粒，将该质粒经EcoR1、Hind III限制性内切酶酶切， 凝胶回收目的片段后与同样用EcoRI和Hind III进行双酶切的pMV361质粒胶回收产物， 按3 :1的摩尔比(目的片段载体)在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接体系为 buffer 缓冲液 I μ 1，目的片段 7 yl，PMV361 载体 I μ I，T4DNA 连接酶 I μ1，*10μ1 的连接体系，16°C，连接过夜。转化入E. coli DH5 α感受态细胞后，利用PMV361质粒所携带的卡那霉素抗性筛选egGlY162-PMV361重组子，对阳性克隆进行PCR扩增鉴定和EcoRI 和Hind III双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为egGlY162-PMV361 ；(4)重组egGlY...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁剑冰，马海梅，祖力皮也·吐尔逊，马秀敏，曹春宝，德里夏提·依米提，朱明，温浩，
申请(专利权)人：新疆医科大学，
类型：发明
国别省市：