本发明专利技术涉及一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏号是CGMCCNO：3844。本发明专利技术构建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫试验鸡两周后，鸡血清HI的平均效价为27；LaSota免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为10%和30%；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为40%和20%；V4免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和10%；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和20%，与常规疫苗相比，本发明专利技术重组弱毒疫苗能够提供更加坚实的免疫保护效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用反向遗传技术和免疫学技术，产生一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，用于制造疫苗。
技术介绍
反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指在体夕卜通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路。 0 ;) (Newcastle disease virus, NDV)是新城疫(ND)的病原体。ND是鸡的高度接触性传染病，可引起鸡100%发病和死亡。新城疫病毒在分类上属单链负股RNA病毒目(Mononegavirales)， 副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒属 (Avulavirus)的成员。病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次编码6种结构蛋白核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、 基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白 (NP)，P，M，F，HN和L蛋白。另外两个蛋白，V和W蛋白由P基因编辑后表达。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素。大部分研究是关于 F和 HN 蛋白对致病性的作用，研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素。NDV毒力差异的分子基础主要决定于FO蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。在感染过程中，NDV HN蛋白首先与敏感细胞表面的唾液酸受体结合，这种结合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F构象发生变化；于是后者的融合肽被释放出来，使病毒的包膜与细 IfiII^^ffi^ ,强毒 F 蛋白的裂解位点为多个碱性氨基酸连续排列，可被机体多个组织器官的多种蛋白酶裂解， 因此，可导致全身性感染。弱毒株在该区域的碱性氨基酸则被中性氨基酸所代替，使相应序列由 r/k112-r-q-k/r115-r-l117 变为 g/e112-r-q-g/e115-r-l117，这种 f 蛋白前体仅能被有限的组织或器官分泌的胰样蛋白酶裂解，感染性很低或无感染性。因此，F蛋白是NDV毒力和致病性的主要决定因素。不少研究已经通过反向遗传技术将弱毒株F蛋白裂解位点突变成强毒株的裂解位点而使弱毒株变成了强毒株，这已被这些重组病毒的致病性试验结果所证实；反之亦然。然而关于HN蛋白对毒力的作用的结果还没有定论。在一些试验中，弱毒骨架中插入编码强毒HN蛋白的嵌合体病毒致病性有了明显增加，例如根据MDT 和ICPI指标判断重组病毒的致病性从弱毒增强为中等毒力；而在另一些试验中用相同的试验方法，在弱毒的骨架中置换强毒HN蛋白，但是重组病毒的毒力没有上升。有人认为，弱毒 ND 病毒载体骨架用于构建重组病毒，很难提供合适的表达强毒HN蛋白基因的全部信息。 自1拟6年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看， 临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型，而常规的 ND 疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。2000年黄勇等在发病的鹅群中，成功分离到了基因VII型新城疫强毒ZJl株， 并进行了全基因组测序，登录号为AF431744。在此基础上， 2005年胡顺林等建立了 NDV强毒株的反向遗传操作平台，成功拯救出了鹅源强毒ZJl株，并对该毒株进行了致弱，但是获救病毒的EID5tl和HA效价均较低，不适合于大规模的生产 οHuang等人分别以弱毒株LaSota和强毒株Beaudette C(BC)为骨架，通过HN基因置换而构建了两株重组嵌合病毒 rlaSoBCHN 和 rBCLaSoHN。rIaSoBCHN 是用弱毒株 LaSota 的 HN 置换了骨架病毒BCHN的重组嵌合病毒。致病性试验结果表明，rlaSoBCHN的毒力比骨架病毒有显著上升，而rBCLaSoHN的毒力比骨架病毒有明显下降，而且重组嵌合病毒的组织嗜性与HN的来源有关，这说明HN是影响NDV毒力的一个重要决定因子。但是 Wakamatsu 等人用 BC 强毒株的 HN 置换 LaSota 骨架病毒而得到的重组嵌合病毒，其致病指数或对鸡致病的严重程度与LaSota相比均未改变 。Estevez 等人以中毒株 Anhinga为骨架病毒，用嗜内脏和嗜神经强毒株的HN进行置换而得到的重组嵌合病毒，其毒力与骨架病毒相比也没有发生明显改变。NDV/LX株是我们从健康鸡群中分离到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/ LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。NDV/LX病毒的ICPI值为0. 12，MDT为110h，按照OIE标准测得HA效价 10. 51og2。基因VII型强毒分离株JS-5-05-GO分离自发病鸭群，其F和HN基因序列号分别为EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分别是1. 91和46小时，HA效价平均为81og2。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于专利技术一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗， 从而解决当前所用疫苗株与流行株基因型不一致的问题。本专利技术表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5 月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO 3844。本专利技术的第二个目的在于专利技术一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗 A-NDV-LX/14的构建方法本专利技术在建立鸡源新本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，王晓泉，刘晓文，胡顺林，刘文博，刘慧谋，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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