重组人类偏肺病毒疫苗制造技术

本发明专利技术公开的重组人类偏肺病毒疫苗，包括重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ５７Ｈ，重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ１７２Ｈ，重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ３５３Ｈ，重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ５７Ｈ＋Ｎ１７２Ｈ、Ｎ５７Ｈ＋Ｎ３５３Ｈ和Ｎ１７２Ｈ＋Ｎ３５３Ｈ，重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ５７Ｈ＋Ｎ１７２Ｈ＋Ｎ３５３Ｈ。本发明专利技术为预防人类感染人类偏肺病毒提供了疫苗，特别适用于老人、儿童、免疫缺陷者预防感染人类偏肺病毒。每年在冬春季节，即人类偏肺病毒感染的高发季节，作为预防人类偏肺病毒感染使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及病毒疫苗，具体涉及重组人类偏肺病毒疫苗。
技术介绍
人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)为荷兰学者于2001年首次在儿童 呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。hMPV是长约131Λ的单负链非节段 RNA病毒，包含编码核衣壳蛋白(N)、核包膜磷酸化蛋白(P)、非糖化基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、转录延长因子(M2.1)、RNA合成调节因子(M2. 2)、小疏水表面蛋白(SH)、主要粘附蛋白(G)、主要聚合酶亚单位(L)基因，顺序为3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。hMPV基因结构和序 列均与禽偏肺病毒(APV)相似，最接近于APV-C亚型，氨基酸同源性高达80%。该病毒可导致人的上下呼吸道感染，其临床特征类似于RSV(呼吸道合胞病毒)， 主要症状包括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。有报道hMPV是老人、儿童、免疫缺陷者 严重呼吸道感染疾病的常见病原体。人类偏肺病毒已发现之后，亚洲、北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染 的流行病学报告，呈现全球流行趋势。在中国重庆和北京也有关于hMPV感染的报道。血 清学研究表明hMPV已经在人群流行50年以上，大多数人在5岁时均已感染过hMPV，4 10. 8%的呼吸道感染住院患儿与hMPV有关。hMPV可同其他一些病原体合并感染，如RSV， SARS-CoV (严重急性呼吸综合征冠状病毒)。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体， 该病毒疫苗对于预防该病毒感染具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供重组人类偏肺病毒疫苗，它能用于预防人类感染人类偏肺病 毒，特别是老人、儿童、免疫缺陷者感染人类偏肺病毒。本专利技术所述的重组人类偏肺病毒疫苗，包括对人类偏肺病毒F基因的第57位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得 的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H ；即将人类偏肺病毒F基因的第57位相对应的氨基酸_天 冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)，氨基酸密码子由AAC变为CAC ；对人类偏肺病毒F基因的第172位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获 得的重组人类偏肺病毒活疫苗W72H ；即将人类偏肺病毒F基因的第172位相对应的氨基 酸-天冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)，氨基酸密码子由AAT变为CAT ；对人类偏肺病毒F基因的第353位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获 得的重组人类偏肺病毒活疫苗N353H ；即将人类偏肺病毒F基因的第353位相对应的氨基 酸-天冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)，氨基酸密码子AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；还包括对人类偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位中的任意两位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H， N57H+N353H, N172H+N353H ；还包括对人类偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位同时进行体外定点 突变和反向遗传(病毒拯救)获得的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。所述的重组人类偏肺病毒疫苗，是将获得的7种人类偏肺病毒分别在Vero-E6细 胞(非洲绿猴肾细胞株)培养繁殖而获得的病毒纯化液，每Iml疫苗含有不少于IO5蚀斑 形成单位(PFU)的人类偏肺病毒。所述的重组人类偏肺病毒疫苗，为N57H、N172H, N353H、N57H+N172H、N57H+N353H、 N172H+N353H.N57H+N172H,N57H+N353H,N172H+N353H7 种重组人类偏肺病毒疫苗中的一种， 或者为其中两种以上的重组人类偏肺病毒疫苗组合而成的混合病毒疫苗。所述的重组人类偏肺病毒疫苗的制备方法如下(1)从临床病人的鼻咽分泌液中分离获得人类偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml标本转移液中，置于冰上，2小时内转移至实验室； 混勻分泌物，在离心机上以1000转/分钟的转速，离心10分钟，弃去上清，再加入2ml硫酸 缓冲液重新悬浮沉淀；将上述2ml重悬液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂(德 国 QIAGEN 公司)提取 RNA，再用 PrimeScriptTM RT Reagent Kit 逆转录试剂(日本 TAKARA 公司)逆转录为cDNA，然后，扩增获得人类偏肺病毒F基因；(2)对人类偏肺病毒F基因进行体外定点突变；采用美国Mratagene公司的定点突变检测试剂盒，将人类偏肺病毒F基因的第57 位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)；即人类偏肺病毒F基 因的第57位相对应的氨基酸密码子由AAC变为CAC、人类偏肺病毒F基因的第172位相对 应的氨基酸密码子由AAT变为CAT、人类偏肺病毒F基因的第353位相对应的氨基酸密码子 由AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；通过以上步骤，获得上述位点的人类偏肺病毒F基因体外定点突变，即需要改变 的氨基酸；通过第一轮的PCR反应，获得改变后的F基因一N57H，W72H，N353H。然后， 在此基础上进行第二轮的PCR反应获得改变后的F基因一N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；最后，在第二轮产物的基础上再进行PCR反应获得3个点均突变的改变后的 F 基因一N57H+N172H+N353H ；将上述体外定点突变后获得的含有7种改变后的F基因转入荷兰Erasmus Institute的Rmchier教授处获得的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体(该表达=Herfst S, De Graaf Μ, Schickli JH, et al. Recovery of human metapneumovirus geneticlineages A and B from cloned cDNA. J Virol,2004,78(15) 8264-8270.)。(3)利用反向遗传系统获得重组人类偏肺病毒疫苗；采用上述获得的7种改变后的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体，再利用反向 遗传系统(Reverse Genetics Systems)或称为病毒拯救(Virus Rescue)的方法获得7种重组人类偏肺病毒，作为人类偏肺病毒的活疫苗。本专利技术为预防人类感染人类偏肺病毒提供了疫苗，特别适用于老人、儿童、免疫缺 陷者预防感染人类偏肺病毒。每年在冬春季节，即人类偏肺病毒感染的高发季节，作为预防 人类偏肺病毒感染使用。具体实施例方式本专利技术所述的重组人类偏肺病毒疫苗的制备方法如下(1)从临床病人的鼻咽分泌液中分离获得人类偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml标本转移液中，置于冰上，2小时内转移至实验室； 混勻分泌物，在离心机上以1000转/分的转速，钟离心10分钟，弃去上清，再加入2ml硫酸 缓冲液重新悬浮沉淀；(标本转移液即用于收集本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．重组人类偏肺病毒疫苗，包括：对人类偏肺病毒Ｆ基因的第５７位进行体外定点突变和反向遗传（病毒拯救）获得的重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ５７Ｈ；即将人类偏肺病毒Ｆ基因的第５７位相对应的氨基酸－天冬酰胺变为组氨酸，氨基酸密码子由ＡＡＣ变为ＣＡＣ；对人类偏肺病毒Ｆ基因的第１７２位进行体外定点突变和反向遗传（病毒拯救）获得的重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ１７２Ｈ；即将人类偏肺病毒Ｆ基因的第１７２位相对应的氨基酸－天冬酰胺变为组氨酸，氨基酸密码子由ＡＡＴ变为ＣＡＴ；对人类偏肺病毒Ｆ基因的第３５３位进行体外定点突变和反向遗传（病毒拯救）获得的重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ３５３Ｈ；即将人类偏肺病毒Ｆ基因的第３５３位相对应的氨基酸－天冬酰胺变为组氨酸，氨基酸密码子ＡＡＣ变为ＣＡＣ；上述氨基酸密码子中的Ａ代表腺嘌呤脱氧核苷酸、Ｔ代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、Ｃ代表胞嘧啶脱氧核苷酸、Ｇ代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；还包括对人类偏肺病毒Ｆ基因的第５７位、第１７２位、第３５３位中的任意两位进行体外定点突变和反向遗传获得的重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ５７Ｈ＋Ｎ１７２Ｈ，Ｎ５７Ｈ＋Ｎ３５３Ｈ，Ｎ１７２Ｈ＋Ｎ３５３Ｈ；还包括对人类偏肺病毒Ｆ基因的第５７位、第１７２位、第３５３位同时进行体外定点突变和反向遗传获得的重组人类偏肺病毒活疫苗Ｎ５７Ｈ＋Ｎ１７２Ｈ＋Ｎ３５３Ｈ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓东，赵耀，张金辉，窦颖，陈昕，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，赵晓东，赵耀，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]