表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株及其构建方法和应用。具体地，本发明专利技术利用重组克隆技术，将包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP替换鸭瘟病毒的US10基因，构建获得缺失US10基因并在其相应位置插入CMV-EGFP表达盒的重组EGFP鸭瘟病毒，该重组病毒能够稳定表达EGFP基因。本发明专利技术的一种鸭瘟病毒重组疫苗株，命名为rDEVUS10-EGFP，微生物保藏号是：CGMCC No.8660。本发明专利技术还涉及构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法，以及重组鸭瘟病毒疫苗株在制备预防鸭瘟和其他禽类传染病的疫苗中的应用。

【技术实现步骤摘要】
表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株及其构建方法和应用
本专利技术涉及重组病毒疫苗株及其构建方法和应用，尤其涉及一种能够稳定表达外源基因的重组鸭瘟病毒株rDEVUS10-EGFP及其构建方法和应用，本专利技术属于生物医药

技术介绍
鸭瘟又称鸭病毒性肠炎(Duckviralenteritis，DVE)，是由鸭瘟病毒(又称鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus，DEV))引起的鸭、鹅等多种雁形目禽类感染的一种急性、热性、接触性传染病。其主要特点是流行广泛，传播迅速，发病率及死亡率高，且不同日龄的鸭均易感，给养鸭业造成巨大经济损失，是危害养鸭业的重要疫病之一。鸭瘟病毒的自然感染仅限于雁形目的鸭科成员(鸭、鹅、天鹅等)。传染源主要是病鸭、病鹅、带毒的家禽及野生水禽。水是本病的自然传播媒介，吸血昆虫可能是本病潜在的传播媒介。感染该病的康复禽有可能成为带毒者，并周期性排毒。鸭瘟病毒与其它疱疹病毒一样，DEV的潜伏和激活都可以引起该病在家养和迁徙水禽中爆发。病毒的感染与品种、年龄和性别无关，成年鸭感染率较幼鸭高。但近年来发现DEV的感染朝低龄化方向发展，且鹅的感染率不断增高，发病率和死亡率多在80％以上。鸭瘟病毒只有一个血清型，免疫接种是防治该病的最有效手段。目前国内外预防鸭瘟使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，在高发季节来临前给鸭群进行免疫注射能有效预防该病。当疫情发生时，在开始初期应当立即对于鸭群中未出现症状的鸭进行紧急免疫接种，可以防止疫病的进一步扩散，对于控制疫情、降低经济损失具有显著效果。然而，随着畜禽集约化养殖业的发展，单价疫苗已显示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施费时费力，多价联合疫苗便成为养殖业最受欢迎的疫病防控产品，因而开展禽病多价联合疫苗成为必然选择。DEV为疱疹病毒，其基因组为双股线性DNA，大小约为168Kb，由共价结合的两个区域组成，包括长独特区(UL)和短独特区(US)。2009年Li等首次报道DEVVAC株的全基因组序列，同年，Liu等报道了由DEVVAC株致弱株DEVClone-03大多数ORF序列(Liuetal.,2009)。序列分析表明DEVVAC基因组的构型为D型基因组(Lietal.,2009)，基因组结构为：UL-IRS-US-TRS。共包括78个开放读码框(ORF)，其中有65个ORF位于UL区，11个ORF位于US区，另外2个ORF(ICP4和IE180)则分别位于IRS区和TRS区(Wuetal.,2012)。疱疹病毒基因组包含大量的复制非必需基因，包括TK、gC、gG、gK、US1、US2、US10、UL41、UL42、US7和US8等。在相关研究中将外源基因插入或替代疱疹病毒的非必须基因，构建重组病毒疫苗，这被认为是一种良好的重组活疫苗病毒载体，目前有关疱疹病毒作为载体的报道包括伪狂犬病载体、传染性喉气管炎病毒载体、马力克氏病毒载体以及火鸡疱疹病毒载体等。随着对鸭瘟病毒研究的不断加深，以DEV为病毒活载体受到更加广泛的关注，DEV作为载体的优势在于该病毒宿主范围较窄，对鸡、火鸡、鸽和哺乳动物均无致病性，因此可在这些非自然宿主呼吸道瞬时增殖而不会对人和其他动物的健康安全造成影响，这对开发DEV病毒活载体疫苗具有重要意义。目前，针对DEV病毒载体研究进展顺利，Wang利用BAC技术将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入至鸭瘟病毒gC基因中，成功构建表达表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒(Wangetal.,2011)。Liu等将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入鸭瘟病毒UL41基因中以及US7与US8基因之间，构建两株表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒，免疫鸭群后均可以对DEV和H5N1亚型禽流感病毒产生免疫保护(Liuetal.,2011)。但是，目前利用DEV非必须基因US10位点开展外源基因的重组病毒构建和应用均未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株的方法；本专利技术所要解决的技术问题之二是提供一种有所述方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株；本专利技术所要解决的技术问题之三是提供所述鸭瘟病毒重组疫苗株在制备预防鸭瘟的重组鸭瘟疫苗中的应用。以及所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟以及其它禽类传染病的重组疫苗中的应用。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：本专利技术的一种构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征在于用包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP替换鸭瘟病毒的US10基因，构建获得缺失US10基因并在其相应位置插入CMV-EGFP表达盒的鸭瘟重组病毒株。在本专利技术所述的方法中，优选的，所述的包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。在本专利技术所述的方法中，优选的，缺失的US10基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术所述的方法中，优选的，所述的CMV启动子来源于含有CMV启动子的质粒，更优选pEGPF-N1质粒。在本专利技术所述的方法中，优选的，包括以下步骤：(1)构建包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP的重组转移载体，其中在所述基因片段CMV-EGFP上下游分别连有扩增得到的位于鸭瘟病毒US10基因两侧的侧翼序列，所述的包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；(2)提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA；(3)利用步骤(1)中获得的重组转移载体与步骤(2)中获得的鸭瘟病毒的完整基因组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病毒，再经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株。在本专利技术所述的方法中，优选的，步骤(1)中用于扩增位于鸭瘟病毒US10基因两侧的侧翼序列的引物如下所示：VL1上游:5’-ATCGATTGACGATGAGCGATCGGAAT-3’VL2下游:5’-CCTAGGGTTGCGCGTTGTGTATAAGT-3’VR1上游:5’-ACGCGTGACTCTGACTGATACTCTAC-3’VR2下游:5’-ATGCATCTAATCGGTTATTTGCTGCT-3’。进一步的，本专利技术还提出了按照以上任一项所述的方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株。其中，在本专利技术的一个优选的实施方案中获得了一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株，命名为rDEVUS10-EGFP株，分类命名是DuckAnatidHerpesvirus，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2013年12月27日，其微生物保藏号是：CGMCCNo.8660。在所述的鸭瘟重组病毒株rDEVUS10-EGFP株中，重组转移载体EGFP基因两端加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征在于用包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV‑EGFP替换鸭瘟病毒的US10基因，构建获得缺失US10基因并在其相应位置插入CMV‑EGFP表达盒的鸭瘟重组病毒株。

【技术特征摘要】
1.一种构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP的重组转移载体，其中在所述基因片段CMV-EGFP上下游分别连有扩增得到的位于鸭瘟病毒US10基因两侧的侧翼序列，所述的包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CMV启动子序列的基因片段CMV-EGFP的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；其中用于扩增位于鸭瘟病毒US10基因两侧的侧翼序列的引物如下所示：VL1上游:5’-ATCGATTGACGATGAGCGATCGGAAT-3’VL2下游:5’-CCTAGGGTTGCGCGTTGTGTATAAGT-3’VR1上游:5’-ACGCGTGACTCTGACTGATACTCTAC-3’VR2下游:5’-ATGCATCTAATCGGTTATTTGCTGCT-3’；(2)提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA；(3)利用步骤(1)中获得的重组转移载体与步骤(2)中获得的鸭瘟病毒的完整基因组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病毒，再经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株。2.按照权利要求1所述的方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株。3.一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株，其特征在于所述的鸭瘟重组病毒株，命名为rDEVUS10-EGFP株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCCNo.8660。4.权利要求2或3所述的鸭瘟重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜旺，李慧昕，韩宗玺，孔宪刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23