本发明专利技术提供了一种新型的基于金纳米簇的增强型甲胎蛋白荧光传感器。以巯基化合物为表面修饰剂制备的金纳米簇，具有良好的荧光性质。在KMnO4或H2O2的氧化作用下，金纳米簇的荧光发生猝灭；如果向猝灭的金纳米簇中加入还原性物质如对氨基苯酚、抗坏血酸、邻苯二酚，荧光则重新得到恢复。利用碱性磷酸酶(ALP)能够催化其底物坏血酸磷酸三钠盐或对氨基苯磷酸盐或邻苯二酚磷酸酯分解生成对氨基苯酚、抗坏血酸、邻苯二酚，以ALP为标记物实现信号放大作用，建立了一种新型、高灵敏的针对甲胎蛋白的免疫传感器。本方法具有操作便捷、灵敏度高与选择性好等优点，为构建基于金属纳米簇的新型免疫荧光传感器提供了借鉴。
【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法
：本专利技术涉及纳米分析检测领域，尤其涉及具有良好荧光性质的金纳米簇在免疫检测方面的应用。
技术介绍
：甲胎蛋白(AFP)是一种分子量约为70KDa的酸性糖蛋白，主要由胚胎时期的肝脏及卵黄囊产生，是一种重要的肿瘤标记物[LiY.J.；MaM.J.；ZhuJ.J.；Anal.Chem.2012,84,10492-10499]。健康的成人体内的AFP含量极少。但是，AFP含量的增加与癌症如肝癌、卵黄囊癌、睾丸癌及鼻咽癌等的发生密切相关。因此，AFP的早期检测可被用于某些癌症的早期临床诊断，对癌症预防具有非常重要的意义[LiuJ.F.；LinG.H.；XiaoC.；XueY.；YangA.K.；RenH.X.；LuW.S.；ZhaoH.；LiX.J.；YuanZ.B.Biosens.Bioelectron.2015,71,82-87]。AFP的常规检测方法有酶联免疫分析法[SunW.；JiaoK.；ZhangC.；ZhangZ.Anal.Chim.Acta2001,434,43-50]、石英晶体微天平[ChouS.；HsuW.；HwangJ.；ChenC.Chin.Chem.2002,48,913-918]、电化学发光法[CaoY.L.；YuanR.；ChaiY.Q.；MaoL.；YangX.；YuanS.R.；YuanY.L.；LiaoY.H.Electroanalysis2011,23,1418-1426]、质谱法[HuS.H.；ZhangS.C.；HuZ.C.；XingZ.；ZhangX.R.Anal.Chem.2007,79,923-929]及表面等离子共振法[ChangY.；ChenR.；LeeY.；ChaoS.；SuL.；LiY.；ChouC.Biosens.Bioelectron.2009,24,1610–1614]等。上述的检测方法具有其各自的优点但同时也存在一定的不足之处，比如仪器构造复杂且价格昂贵、操作繁琐，样品用量较多，灵敏度不够高、线性范围较窄，选择性不够好，在临床应用上费用高、耗时久等。因此，建立成本低廉，操作简便，灵敏度高，选择性好的AFP免疫分析方法具有十分重要的理论意义及实际应用价值。荧光分析法在分析检测领域的地位不容小觑。因其具备诸多优点如选择性好、灵敏度高、样品用量少、操作简便、快速、线性范围宽等，使得荧光分析法在化学、环境、生物、医药等众多领域均得到广泛应用[ZhangK.；GuoJ.K.；NieJ.J.；DuB.Y.；XuD.J.Sens.Actuators,B2014,190,279-287；HeY,XiongLH,XingXJ,TangH.W.；PangD.W.Biosens.Bioelectron.2013,42,467-473；WenF,DongYH,FengL,WangS.；ZhangS.C.；ZhangX.R.Anal.Chem.2011,83,1193-1196]。随着纳米技术的快速发展，各类具有良好荧光性质的新型纳米材料不断涌现，为创建新型荧光传感器提供了素材。基于纳米材料的荧光传感器尺寸更小，灵敏度更高，选择性更好，因此引起了研究者们的广泛瞩目。金属纳米簇是近年来刚刚兴起的一种新型荧光纳米材料，其由几个到约一百个原子组成。金属纳米簇由于具有超小尺寸(<2nm)、低毒性、良好的光稳定性、大的斯托克斯位移等优点，正成为生物荧光传感器构建工作中极具吸引力的一种纳米材料。目前，很多利用金属纳米簇建立的荧光传感分析均是荧光猝灭型传感器，被广泛应用于金属离子[SunJ.；YueY.；WangP.；HeH.L.；JinY.D.J.Mater.Chem.C2013,1,908-913；ZhuH.J.；YuT.；XuH.D.；ZhangK.；JiangH.；ZhangZ.P.；WangZ.Y.；WangS.H.ACSAppl.Mater.Interfaces2014,6,21461-21467]及生物分子，如乙酰胆碱[LiH.C.；GuoY.X.；XiaoL.H.；ChenB.Biosens.Bioelectron.2014,59,289-292]，胰蛋白酶[HuL.Z.；HanS.；ParveenS.；YuanY.L.；ZhangL.；XuG.B.Biosens.Bioelectron.2012,32,297-299]和葡萄糖[XiaX.；D.；LongY.F.；WangJ.X.Anal.Chim.Acta2013,772,81-86]等的检测。但是，猝灭型传感器的检测背景较高，容易受到非被测物之外的其它因素(如溶剂、基体效应等)的影响，从而产生较大误差。与应用更为广泛的猝灭型荧光传感器相比，荧光增强型传感器检测限更低、灵敏度更高、干扰因素也相对较少，在荧光传感分析领域受到推崇[ZhouZ.X.；DuY.；DongS.J.；Biosens.Bioelectron.2011,28,33-37；HuangC.C.；ChenC.T.；ShiangY.C.；LinZ.H.；ChangH.T.；Anal.Chem.2009,81,875-882]。到目前为止，基于金纳米簇的荧光免疫分析仅局限在利用金纳米簇标记二抗，通过金纳米簇自身的荧光信号进行检测[PengJ.；FengL.N.；ZhangK.；LiX.H.；JiangL.P.；ZhuJ.J.；Chem.Eur.J.2012,18,5261–5268；YangG.H.；ShiJ.J.；WangS.；XiongW.W.；JiangL.P.；BurdaC.；ZhuJ.J.；Chem.Commun.2013,49,10757-107]。本专利技术中，发现强氧化剂如高锰酸钾或双氧水破坏了金纳米簇的表面结构，导致金纳米簇的荧光猝灭；而碱性磷酸酶(ALP)的磷酸酯底物的水解产物如对氨基苯酚、抗坏血酸、邻苯二酚使金纳米簇的表面结构重新恢复，从而使被猝灭的荧光重新得到恢复。以ALP作为标记物，建立了一种新型的基于金纳米簇的高灵敏荧光免疫分析方法，成功实现了对甲胎蛋白的高灵敏、选择性测定。本专利技术的特点在于发现通过氧化还原反应调控金纳米簇的表面状态从而调控荧光的猝灭及恢复；结合ALP的催化放大作用，将金纳米簇成功应用于免疫分析中。具有思路新颖、操作便捷、成本低、灵敏度高与选择性好等优点，为构建基于金属纳米簇的增强型荧光传感器在生物检测方面的应用提供了良好的借鉴。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种新型的荧光分析思路，利用氧化还原反应调控金纳米簇荧光的猝灭与恢复，实现便捷、灵敏的甲胎蛋白免疫测定。本专利技术的目的可通过如下技术措施来实现：1、一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法，其特征在于：a、将一定量的HAuCl4与一定量的修饰剂混合并用NaOH调节pH至碱性，37℃下搅拌反应24h，得到金纳米簇用超纯水透析12h作为荧光探针；b、用负载有Au纳米粒子的层状CaCO3微粒固定碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗，形成CaCO3-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物，作为信号标签诱导检测信号的产生；CaCO3-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物的制备方法如下：一定量的柠檬酸三钠盐本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法，其特征在于：a、将一定量的HAuCl4与修饰剂混合并用NaOH调节pH至碱性，37℃下搅拌反应24h，得到金纳米簇用超纯水透析12h作为荧光探针；b、用负载有Au纳米粒子的层状CaCO3微粒固定碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗，形成CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物，作为信号标签诱导检测信号的产生；CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物的制备方法如下：一定量的柠檬酸三钠盐与氯金酸混合后，煮沸搅拌一段时间，冷却得到Au纳米粒子；一定量的吐温‑80，氯化钙和碳酸钠混合并超声，离心得到层状CaCO3微粒；将CaCO3微粒分散于Au纳米粒子中超声，离心得到CaCO3‑Au纳米粒子复合物；将一定量的甲胎蛋白二抗，碱性磷酸酶和CaCO3‑Au纳米粒子复合物混合震荡2h，再加入一定的牛血清白蛋白封闭，30min后离心并重新分散，得到CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物；c、将30μL 0.5mg/mL的甲胎蛋白一抗加入到微孔板中，4℃下过夜后用含有0.05％吐温‑20的pH＝7.4的Tris‑HCl缓冲液作为洗涤液洗涤，并用含有3％(w/v)牛血清白蛋白的pH＝7.4的Tris‑HCl溶液作为封闭液封闭30min，然后将不同浓度的甲胎蛋白抗原加入到微孔板中，37℃条件下反应1h；在一抗与抗原特异性结合后，加入CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物反应1h，洗涤移除多余的生物复合物；最后，向微孔板中加入50μL 0.1mol/L的碱性磷酸酶的催化底物溶液和50μL pH＝9.1的Tris‑HCl缓冲液，反应25min后加入猝灭剂与金纳米簇形成的混合液；反应5min后测定荧光强度。...
【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白的免疫测定方法，其特征在于：a、将一定量的HAuCl4与修饰剂混合并用NaOH调节pH至碱性，37℃下搅拌反应24h，得到金纳米簇用超纯水透析12h作为荧光探针；b、通过Au纳米粒子的层状CaCO3微粒固定碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗，形成CaCO3-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物，作为信号标签诱导检测信号的产生；CaCO3-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物的制备方法如下：一定量的柠檬酸三钠盐与氯金酸混合后，煮沸搅拌一段时间，冷却得到Au纳米粒子；一定量的吐温-80，氯化钙和碳酸钠混合并超声，离心得到层状CaCO3微粒；将CaCO3微粒分散于Au纳米粒子中超声，离心得到CaCO3-Au纳米粒子复合物；将一定量的甲胎蛋白二抗，碱性磷酸酶和CaCO3-Au纳米粒子复合物混合震荡2h，再加入一定的牛血清白蛋白封闭，30min后离心并重新分散，得到CaCO3-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物；c、将30μL0.5mg/mL的甲胎蛋白一抗加入到微孔板中，4℃下过夜后用含有0.05％吐温-20的pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液洗涤，并用含有3％(w/v)牛血清白蛋白的pH＝7.4的Tri...
【专利技术属性】
技术研发人员：王光丽，胡雪连，吴秀明，方馨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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