一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法技术

本申请涉及一种鼻咽癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法。根据鼻咽癌来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，鼻咽癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。本发明专利技术的培养与鉴定方法以及特有的鼻咽癌类器官培养基，可以成功稳定的培养出与亲本肿瘤病理生理学特征、基因分型高度一致，组织形态高度相似的鼻咽癌类器官。

A Method for Cultivation and Identification of Nasopharyngeal Carcinoma Organs

The present application relates to a culture medium, a culture method and an identification method for nasopharyngeal carcinoma organs. \u6839\u636e\u9f3b\u54bd\u764c\u6765\u6e90\u7ec6\u80de\u7684\u57f9\u517b\u751f\u957f\u7279\u70b9\uff0c\u9009\u7528\u4e86\u591a\u79cd\u7ec6\u80de\u56e0\u5b50\u6210\u4efd\u6309\u7167\u4e00\u5b9a\u7684\u6bd4\u4f8b\u8fdb\u884c\u8c03\u548c\uff0c\u7ecf\u8fc7\u8c03\u548c\u7684\u57f9\u517b\u57fa\u4e2d\u7ec6\u80de\u56e0\u5b50\uff0c\u4fe1\u53f7\u901a\u8def\u8c03\u63a7\u56e0\u5b50\u542b\u91cf\u9002\u5b9c\uff0c\u9f3b\u54bd\u764c\u7ec6\u80de\u80fd\u591f\u6709\u6548\u7684\u57283D\u73af\u5883\u4e2d\u5f62\u6210\u7c7b\u5668\u5b98\u3002 The cultivation and identification method and the unique organ culture medium of nasopharyngeal carcinoma can successfully and steadily cultivate nasopharyngeal carcinoma organs which are highly consistent with the pathophysiological characteristics and genotyping of parental tumors and have highly similar tissue morphology.

【技术实现步骤摘要】
一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法
本专利技术涉及类器官培养领域，进一步涉及鼻咽癌类器官培养领域，特别是用于鼻咽癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法。
技术介绍
在我国鼻咽癌已经成为耳鼻咽喉恶性肿瘤的主要癌种和病死因素，在中国南部两广地区(如广东、广西等)尤其高发。放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，Ⅰ、Ⅱ期鼻咽癌单纯放疗即可获得良好的治疗效果，初次治疗的5年总生存率可达75％-84.5％。然而首程治疗后复发和转移率高达10-36％。另外，复发鼻咽癌患者再程放化疗效果不佳，有报道5年生存率仅为16％-20％。近年来突飞猛进的靶向治疗和免疫治疗给复发鼻咽癌患者带来希望的同时，也带来如何从众多的免疫治疗药物中做出最佳选择这一重要问题。所有的癌症研究都依赖稳定的细胞供应—可在实验室中培养的正常细胞和癌性细胞。肿瘤3D类器官养技术已经存在了较长时间，在体外用各种必要的生长因子来模拟机体内环境的条件下，提取细胞加入到3D基质胶中培养从而得到了细胞团块样组织，其包含了不同组织来源的上皮细胞结构，这种能不断自我增殖及分化的细胞团被称之为类器官。这种高效率的类器官培养可以用来研究肿瘤的分子信号通路转导和抗肿瘤药物的研发与筛选以及肿瘤患者的靶向治疗。现有技术中，研究较多的类器官有结肠(SATOT，2011；CN105754948A；CN108396010A)、胃(BARTFELDS，2015)、前列腺(GAOD，2014)、胰腺(2015)、肝(CN1013237888A；BROUTIERL，2018)等，但对于鼻咽癌组织，还主要是普通的2D原代培养技术以及常规原代鉴定方法。在二维培养过程中鼻咽癌组织难以或不能充分表达出鼻咽癌组织的特性，使得培养的鼻咽癌组织原代细胞与患者来源亲本鼻咽癌组织有所差异，不利于研究的进行，同时，常规免疫组化、HE染色不能证明所培养的原代鼻咽癌细胞与患者体内的肿瘤细胞基因组相匹配。而在3D培养中，缺少必要的适宜的培养基的情况下，鼻咽癌组织的培养同样不利，难以充分模拟出体内鼻咽部粘膜组织及鼻咽癌组织细胞生理特点。目前暂无关于鼻咽癌组织类器官培养方法以及鉴定的研究及报道，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、即培养基配方以及鼻咽癌类器官鉴定技术尚无尝试及报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种鼻咽癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种鼻咽癌类器官的培养基，上述培养基包括以下组分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、ProstaglandinE2、SB202190和FGF-7。进一步地，培养基各成分的含量如下：B27，40-60X稀释；N-acetylcysteine0.5-10mM；EGF1-10ng/ml；Noggin10-500ng/ml、R-spondin150-500ng/ml；A83-01100-1000nM；HGF1-100ng/ml；Nicotinamide1-100mM；Y-276321-50μM；Wnt3a50-500ng/ml；Glutmax50-200X稀释；Heregulinβ-15-100ng/ml；Gastrin0.1-10nM；FGF-101-100ng/ml；ProstaglandinE20.1-10μM；SB2021901-100μM；FGF-71-100ng/ml。进一步地，培养基各成分的含量如下：B27，50X稀释；N-acetylcysteine1mM；EGF5ng/ml；Noggin100ng/ml、R-spondin1250ng/ml；A83-01500nM；HGF10ng/ml；Nicotinamide10mM；Y-2763210μM；Wnt3a250ng/ml；Glutmax100X稀释；Heregulinβ-120ng/ml；Gastrin1nM；FGF-1010ng/ml；ProstaglandinE21μM；SB20219010μM；FGF-710ng/ml。本专利技术还提供了一种根据上述培养基培养鼻咽癌类器官的方法，具体方法如下：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移恒温摇床消化；第一次消化结束后，离心弃上清，加消化酶II吹打重悬，将离心管放入恒温摇床消化，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取红细胞裂解液重悬细胞后加入HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,将胶滴接种至培养皿中；将培养皿静置，观察胶滴是否流动，若不流动，放入恒温孵箱，倒置；加入已预热好的鼻咽癌类器官培养基；定期更换培养基，培养出鼻咽癌类器官。进一步地，上述培养方法具体为：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移至37℃、220rpm恒温摇床消化1.5小时左右；第一次消化结束后，离心弃上清，加2ml消化酶II吹打重悬，将离心管放入37℃、220rpm恒温摇床消化10min，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加2mlHanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用70μm细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取1ml红细胞裂解液重悬细胞2-3min后加入1mlHBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,3000细胞每50μl胶滴混合液，用100μl移液枪将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约30μl；将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃,5％CO2恒温孵箱，倒置45min；加入已预热好的鼻咽癌类器官培养基，约2ml；每间隔2-3天更换一次培养基，培养出鼻咽癌类器官。进一步地，胶滴混合液中，DMEM/F12培养基与matrigel的比例为1:2；消化酶I为collagenasetypeII和分散酶；消化酶II为TrypLEExpress和DNaseI酶。本专利技术还提供了一种鉴定上述鼻咽癌类器官的方法，具体方法如下步骤：(1)鼻咽癌组织做肿瘤全外显子测序，患者血液做EBV全基因测序；(2)类器官培养成功第一代并传代后，分别将类器官第一代、第三代、第五代、第七代、第九代做肿瘤全外显子和EBV全基因测序；(3)若患者病理诊断结果为非角化未分化鼻咽癌，则第一代类器官做HE染色证实其为肿瘤细胞；若患者病理诊断结果为分化的鼻咽癌，则需HE染色及免疫组化检测上皮标志物角蛋白的表达；(4)判断类器官第一代肿瘤全外显子测序结果与患者肿瘤组织测序结果比较是否一致、患者血液中EBV测序和类器官EBV测序结果是否一致；上述两种测序比较结果一致时，则证明该类器官是该患者来源的鼻咽癌肿瘤细胞；(5)类器官第一、三、五、七、九测序结果比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼻咽癌类器官的培养基，其特征在于，上述培养基包括以下组分：B27、N‑acetylcysteine、EGF、Noggin、R‑spondin 1、A83‑01、HGF、Nicotinamide、Y‑27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ‑1、Gastrin、FGF‑10、Prostaglandin E2、SB202190和FGF‑7。

【技术特征摘要】
1.一种鼻咽癌类器官的培养基，其特征在于，上述培养基包括以下组分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、ProstaglandinE2、SB202190和FGF-7。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，各组分的含量为：B27，40-60X稀释；N-acetylcysteine0.5-10mM；EGF1-10ng/ml；Noggin10-500ng/ml、R-spondin150-500ng/ml；A83-01100-1000nM；HGF1-100ng/ml；Nicotinamide1-100mM；Y-276321-50μM；Wnt3a50-500ng/ml；Glutmax50-200X稀释；Heregulinβ-15-100ng/ml；Gastrin0.1-10nM；FGF-101-100ng/ml；ProstaglandinE20.1-10μM；SB2021901-100μM；FGF-71-100ng/ml。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，各组分的含量为：B27，50X稀释；N-acetylcysteine1mM；EGF5ng/ml；Noggin100ng/ml、R-spondin1250ng/ml；A83-01500nM；HGF10ng/ml；Nicotinamide10mM；Y-2763210μM；Wnt3a250ng/ml；Glutmax100X稀释；Heregulinβ-120ng/ml；Gastrin1nM；FGF-1010ng/ml；ProstaglandinE21μM；SB20219010μM；FGF-710ng/ml。4.一种鼻咽癌类器官的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移恒温摇床消化；第一次消化结束后，离心弃上清，加消化酶II吹打重悬，将离心管放入恒温摇床消化，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取红细胞裂解液重悬细胞后加入HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,将...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，王显文，唐浩程，韩日，赵云腾，汪珂，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东,44