本发明专利技术涉及单细胞分离领域，公开了从肿瘤样品中分离单细胞的方法。所述方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10‑1250:0.1‑20:500‑100000:1。本发明专利技术能够在总消化时间较短的情况下实现单细胞的高收率和高活率提取，特别是胰腺组织，攻克了现有胰腺组织单细胞收率和活率较低的难题。
Isolation of Single Cells from Tumor Samples
The invention relates to the field of single cell separation, and discloses a method for separating single cells from tumor samples. The method includes: mixing the tumor sample with digestive juice for digestion, which contains type VIII collagenase, neutral protease, trypsin inhibitor and deoxyribonuclease, in which the ratio of the activity units of type VIII collagenase, neutral protease, trypsin inhibitor and deoxyribonuclease is 10_1250:0.1_20:500_100000:1. The invention can realize high yield and high activity extraction of single cell under the condition of short total digestion time, especially for pancreatic tissue, and overcome the difficult problem of low yield and low activity of single cell of existing pancreatic tissue.
【技术实现步骤摘要】
从肿瘤样品中分离单细胞的方法
本专利技术涉及单细胞分离领域，具体涉及从肿瘤样品中分离单细胞的方法。
技术介绍
胰腺是人体中兼具内分泌和外分泌功能的器官。组织学上包含胰岛细胞、腺泡细胞、导管细胞以及间质细胞等多个细胞组分。胰腺产生分泌的胰液中含有胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等多种消化酶。随着近年来单细胞分析技术的兴起，人们对与人体组织器官的研究从不同成分混合，互相干扰的整体组织分析逐渐深入到对构成组织器官的单个细胞的研究，其重要性不言而喻。而在胰腺研究领域，由于胰腺器官大体上柔软而脆弱、组织学上成分复杂且因为强效的胰酶而容易发生自身消化，使得胰腺单细胞研究往往止步于第一步——也即可供分析的胰腺组织单细胞的获取。人体或动物模型组织器官单细胞分离方法，从最初的毛细管吸取，到流式分选再到微流体技术，众多的单细胞分离技术在不同的组织当中或多或少都取得了较为满意的结果，但在胰腺组织上则差强人意。通过查阅文献可知，目前研究人员在分离小鼠胰腺癌单细胞时，大多采用以II型胶原酶为主的酶消化解离方法，但是，胰腺单细胞研究者均表示在胰腺单细胞分离时遇到了极大的挑战，要么单细胞收率不高，要么细胞活率较低，因此，开发能够有效分离的胰腺单细胞的制剂或方法具有极为重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的单细胞收率和细胞活率较低的问题，提供一种新的从肿瘤样品中分离单细胞的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种从肿瘤样品中分离单细胞的方法，该方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:0.1-20:500-100000:1。通过上述技术方案，本专利技术能够在总消化时间较短的情况下实现单细胞的高收率和高活率提取，特别是基于胰腺组织的单细胞分离，攻克了现有胰腺组织单细胞收率和活率均较低的难题，为胰腺组织单细胞的分离指明了方向，有利于促进对胰腺组织的进一步研究。附图说明图1和图2是使用根据本专利技术具体实施方式的方法从胰腺组织分离单细胞的结果图；图3至图5分别是使用不同的参比方法从胰腺组织分离单细胞的结果图。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力单位”反应的是酶含量的多少，指在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活力单位(IU，又称U)。其中，VIII型胶原酶的酶活力单位的定义是：在pH7.5和37℃的条件下，5h内水解胶原产生相当于1μmol的L-亮氨酸的酶量为一个酶活力单位。中性蛋白酶的酶活力单位的定义是：在pH7.5和37℃的条件下，每分钟水解酪蛋白产生相当于1μmol酪氨酸的Folin阳性氨基酸或肽的酶量为一个酶活力单位。胰蛋白酶抑制剂的酶活力单位的定义是：能抑制一个胰蛋白酶酶活力单位的活力称为一个抑制剂酶活力单位(U)，在pH7.5和25℃的条件下，每秒钟水解1μmol的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为一个胰蛋白酶酶活力单位。脱氧核糖核酸酶的酶活力单位的定义是：在pH8.0和37℃的条件下，10分钟内能够完全降解1μg的pBR322质粒DNA所需的酶量为一个酶活力单位。本专利技术提供的从肿瘤样品中分离单细胞的方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶。所述方法中，VIII型胶原酶与脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:1，优选为50-625:1，如50:1、80:1、100:1、105:1、110:1、120:1、130:1、150:1、180:1、200:1、220:1、240:1、260:1、280:1、300:1、310:1、312:1、315:1、320:1、400:1、450:1、500:1、550:1、600:1、610:1、620:1、625:1或上述数值之间的任意值。所述方法中，中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为0.1-20:1，优选为0.5-10:1，如0.5:1、1:1、1.2:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、4.8:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或上述数值之间的任意值。所述方法中，胰蛋白酶抑制剂与脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为500-100000:1，优选为2000-50000:1，如2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、5500:1、6000:1、8000:1、9000:1、10000:1、12000:1、15000:1、18000:1、20000:1、22000:1、24000:1、25000:1、30000:1、35000:1、40000:1、45000:1、48000:1、50000:1或上述数值之间的任意值。胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。胶原酶主要由溶组织梭状芽孢杆菌经发酵培养，提取、精制而得，也可以从猪胰脏中提取而得。本专利技术中，所述胶原酶为VIII型胶原酶，例如，可以为Sigma的Cat:C2139。本专利技术中，对中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶的具体种类没有特别的要求，可以为本领域常见的各种选择。优选地，所述中性蛋白酶为DispaseII。例如，Roche的Cat:4942078001。优选地，所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI。例如，NEB的Cat:M0303S。本专利技术中，胰蛋白酶抑制剂能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活，可以选择本领域常规使用的胰蛋白酶抑制剂。例如，Sigma的Cat:T6522。本专利技术中，所述消化液含有溶剂。相对于每毫克的VIII型胶原酶，所述溶剂的含量可以为0.1-12.5mL，优选为0.2-3mL，如0.2mL、0.4mL、0.5mL、0.8mL、1mL、1.2mL、1.3mL、1.5mL、2mL、2.5mL或上述数值之间的任意值。本专利技术中，所述溶剂可以为各种常见的保存或溶解酶制剂的试剂，优选地，所述溶剂为含有4-10体积％胎牛血清的磷酸盐缓冲液。本专利技术中，对所述消化液的用量没有特别的要求，只要能够浸没所述样品即可。优选情况下，相对于体积为1cm3的肿瘤样品，所述消化液的用量为20-45mL，如20mL、25mL、26mL、27mL、28mL、30mL、32mL、35mL、40mL、45mL或上述数值之间的任意值。本专利技术中，为了更好地进行消化，所述肿瘤样品的体积优选是1-2cm×1-2cm×0.5-2cm，如1.5cm×1.5cm×0.5cm。本专利技术中，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从肿瘤样品中分离单细胞的方法，其特征在于，该方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10‑1250:0.1‑20:500‑100000:1，优选为50‑625:0.5‑10:2000‑50000:1。
【技术特征摘要】
1.一种从肿瘤样品中分离单细胞的方法，其特征在于，该方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:0.1-20:500-100000:1，优选为50-625:0.5-10:2000-50000:1。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述中性蛋白酶为DispaseII；和/或，所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每毫克的VIII型胶原酶，所述消化液中的溶剂的含量为0.1-12.5mL。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述溶剂为含有4-10体积％胎牛血清的磷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴文铭，彭俊雅，陈澔，黄丹，刘路路，洪夏飞，丛林，李冬晶，赵玉沛，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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