定量肽或蛋白质分析制造技术

本发明专利技术根据基于浴铜灵的组合物复合物，如浴铜灵二磺酸二钠盐水合物复合物，提供尤其适用于质谱分析的肽和/或蛋白质定量方法、套组和组合物。所述方法是使用较小样品体积的单步快速吸光度方法。其产生具有高信背比的稳固信号并且精确定量具有低可变性和高灵敏度的甚至复杂的肽混合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定量肽或蛋白质分析相关申请的交叉参考本申请要求2014年6月11日申请的美国临时专利申请第62/010,594号的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。
适用于在分析之前通过质谱分析(MS)和其它类型的分析测定小体积样品的浓度的肽和/或蛋白质分析方法、组合物以及套组。
技术介绍
质谱分析(MS)是用于在多个样品之间进行数千种蛋白质的同时鉴别和相对定量的灵敏方法。MS仪器的持续进展不断推动科学界能够在极大程度上表征复杂的生物学系统中的蛋白质动力学。尽管MS功能，在无显著预注入特征化或标准化的情况下分析大多数MS样品，因为当前监测和测量蛋白质的方法，如UV吸收或二喹啉甲酸(BCA)分析在无肽的情况下效果较差，消耗过多的有价值的样品，并且不具有所需灵敏度。此样品特征化和标准化缺乏导致MS实验标准化和再现性的困难和显著的低生产率仪器时间。可商购的比色蛋白质和肽溶液定量方法包括缩二脲(Gornall等人《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》177(1949)751)、Lowry(Lowry等人《生物化学杂志》193(1951)265、二喹啉甲酸(BCA)(Smith等人《分析生物化学(Anal.Biochem.)》150(1985)76)、考马斯蓝G-250染料结合(Bradford,《分析生物化学》72(1976)248)以及胶态金(Stoscheck,《分析生物化学》160(1987)301)。缩二脲方法是基于形成与铜离子的复合物的蛋白质。肽氮在碱性条件下与铜(II)离子结合，产生紫色颜色。产物的吸收最大值是550nm。灵敏度是1mg蛋白质/ml到6mg蛋白质/ml。缩二脲方法是相比于比色蛋白质测定的其它商购方法相对不灵敏的蛋白质测定方法。另一方法组合缩二脲反应和铜(1)-浴铜灵螯合反应(通过与铜-浴铜灵螯合反应组合的逆缩二脲方法测定蛋白质。《临床化学学报(ClinicaChimicaActa.)》,216(1993)103-111)。在此方法中，样品蛋白质在第一步骤期间形成Cu2+-蛋白质螯合复合物(缩二脲反应)。通过抗坏血酸将过量Cu2+还原成Cu+，使得Cu+在第二步骤期间形成Cu+-浴铜灵螯合复合物。所形成的Cu+-浴铜灵螯合复合物的量与蛋白质浓度成反比。此为使用浴铜灵螯合剂测定蛋白质浓度的阴性或间接分析。劳里法(Lowrymethod)是经修改的缩二脲反应。其在两个步骤中进行：首先，肽键在碱性条件下与铜(II)离子反应，接着通过芳香族氨基酸的铜催化氧化使福林-乔卡梯奥磷钼酸-磷钨酸还原成杂多钼蓝。产物的吸收最大值是750nm。劳里法比缩二脲方法更灵敏，对于牛血清白蛋白(BSA)，线性灵敏度为0.1mg蛋白质/ml到1.5mg蛋白质/ml。某些氨基酸、清洁剂、脂质、糖和核酸干扰反应。反应是pH依赖性的并且pH应保持在pH10与pH10.5之间。BCA方法与劳里法有关，因为蛋白质中的肽键首先还原铜离子(Cu2+)以在碱性介质中产生四齿亚铜离子(Cu1+)复合物。接着使亚铜离子复合物与BCA(每个Cu1+2个分子BCA)反应以形成可以在562nm处测量到的深紫色。下文显示BCA-铜反应：因为BCA在碱性介质中是稳定的，所以相比于劳里法中所需的两个步骤，BCA方法可以在一个步骤中进行。BCA方法较佳包容相比于劳里法的样品中的潜在抑制性或干扰化合物。举例来说，相比于可以存在并且不会干扰劳里法的仅1％SDS、0.03％TritonX-100和0.062％Tween-20，至多5％的十二烷基硫酸钠(SDS)、TritonX-100和Tween-20中的每一个可以存在并且不会干扰BCA方法。相比于劳里法，BCA方法也提高灵敏度和扩展的线性工作范围。MICROBCATM蛋白质分析套组(赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific))准许通过使用较大样品体积定量稀样品溶液(0.5μg/ml到20μg/ml)以获得更高灵敏度。尽管灵敏度提高，样品体积要求限制或预防其定量多种肽样品的用途。定量肽的经修改的BCA分析(Kapoor等人《分析型生物化学(AnalyticalBiochemistry)》,393(2009)138-140)确认测量肽浓度的困难，因为高肽间变化，主要因为肽疏水性。通过在95℃下在SDS存在下处理五分钟，之后与BCA工作试剂一起孵育来使肽变性，经修改的BCA方法评估肽浓度。然而，低于500μg/ml的数据极接近噪声水平并且因此为不可靠的。美国专利第4,839,295号公开使用二喹啉甲酸作为检测蛋白质的螯合剂，测量在562nm处的吸光度。胶态金方法是比色蛋白质测定方法中最灵敏的方法。其灵敏度是约2μg/ml到20μg/ml蛋白质。然而，存在显著的蛋白质到蛋白质变化。与胶态金结合的蛋白质造成与溶液中蛋白质的量成正比的胶态金吸光度转变。除硫醇和十二烷基硫酸钠(SDS)外最常见的试剂与胶态金方法相容。考马斯蓝G-250染料结合方法是基于当考马斯蓝G-250结合酸性介质中的蛋白质时发生的470nm到595nm的即时吸光度转变。显色快速并且分析可以在十分钟内进行。考马斯蓝G-250染料结合方法通过除清洁剂外的常见试剂相对无干扰。存在适度蛋白质到蛋白质变化并且方法不会与肽一起良好作用。总蛋白质分析(Sozgen等人,Talanta,68(2006)1601-1609在碱性介质中利用铜(II)新亚铜试剂的分光光度总蛋白质分析)在具有氢氧化物-碳酸盐-酒石酸盐溶液的碱性介质中使用铜(II)新亚铜试剂(Nc)试剂，其中新亚铜试剂作为螯合剂。在40℃下培育30分钟之后，在450nm处相对于试剂空白读取Cu(I)-Nc复合物的还原产物的吸光度。此分析具有有限的灵敏度，因为碱性水溶液中的新亚铜试剂的有限溶解度。美国专利第5,693,291号公开定量蛋白质方法。所述方法是间接两步法。其使用两种试剂：试剂A(酒石酸盐溶液和硫酸铜)和试剂B(还原剂，例如抗坏血酸和浴铜灵螯合剂)。试剂A含有0.7到2mmol/lCu2+离子和2到4mmol/l含酒石酸盐的碱性溶液。试剂B含有1到1.5mmol/l抗坏血酸和0.5到0.8mmol/l浴铜灵。试剂A与试剂B的比例是1:8到1:12，即，1份试剂A与8-12份试剂B。试剂A和试剂B的组合体积在750μl与3000μl之间，其相对较大。方法的步骤一混合100μl试剂A与50μl样品，继而在室温下培育5分钟到60分钟。方法的步骤二将1ml试剂B添加到步骤一混合物中，继而简单混合并且在485nm处读取。此阴性或间接分析通过浴铜灵螯合样品之前与之后的吸光度差异对蛋白质进行定量。因此，与直接定量蛋白质的阳性或直接分析相比不太准确。其也使用较大的标准蛋白质体积比试剂(体积标准蛋白质比试剂A是1:1.6到1:2.4)。本文所提供的方法克服此类缺点并且提供额外益处。
技术实现思路
本文所提供的方法的一种非限制性用途为用于肽或肽混合物的MS定量。根据本专利技术的方法使用较小样品体积并且产生相比于其它方法信噪比(S/N)较高的稳固信号。本文中提供的方法精确定量复杂的肽样品，如通过变化率较低的蛋白质、细胞裂解物、血浆或血清样品的胰蛋白酶消化产生的那些。本文所提供的一个实施例为用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述方法包含(a)将所述样品与包含复合物的定量分析试剂组合物组合以形成混合物，其中所述复合物含有下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.11 US 62/0105941.一种用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述方法包含(a)将所述样品与包含复合物的定量分析试剂组合物组合以形成混合物，其中所述复合物含有下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物：(b)在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及(c)在450nm到500nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在(c)之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度的标准物的至少一种样品的吸光度来测定所述样品中的肽或蛋白质浓度。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标准物选自由以下组成的群组：肽、肽混合物或蛋白质消化物。4.根据权利要求1所述的方法，其在所述样品的质谱分析之前进行。5.根据权利要求1所述的方法，其中(a)中的所述试剂组合物进一步包含酒石酸盐和硫酸铜。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培育温度选自由以下组成的群组：室温到约45℃、约19℃到约22℃，约37℃和约45℃。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品体积选自由以下组成的群组：约5μl到约20μl，约5μl，约10μl到20μl，约15μl到从20μl，并且不超过约200μl。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含多种肽。9.根据权利要求1所述的方法，其中吸光度通过自动化微量培养板读取器测定。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述标准物包含已知浓度的肽、肽混合物或肽消化物。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品处于选自由以下组成的群组的溶剂中：水性溶剂、有机溶剂以及其组合。12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在(c)之后通过质谱分析来分析所述肽。13.根据权利要求1所述的方法，其中分析组分含有有机溶剂或清洁剂中的至少一种以提高肽或蛋白质溶解度。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂组合物是具有约50％乙腈的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物。15.一种用于测定样品中的肽或蛋白质浓度的直接方法，所述方法包含(a)将样品与定量分析试剂组合物组合，所述组合物包含具有50％乙腈的复合物以形成混合物，其中所述复合物含有下文所示的浴铜灵二磺酸二钠盐水合物：(b)在足以形成彩色复合物的条件下培育混合物；以及(c)在450nm到500nm处测量彩色复合物的吸光度作为样品中的肽或蛋白质浓度的直接指示物。16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包含在(c)之后通过比较直接测量到的吸光度与含有已知浓度的标准物的至少一种样品的吸光度来测定所述样品中的肽或蛋白质浓度。17.根据权利要求15所述的方法，其中(a)中的所述试剂组合物进一步包...

【专利技术属性】
技术研发人员：JP哈尼，CL埃蒂内，S侯，E拉加，R贾纳帕蒂，
申请(专利权)人：皮尔斯生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US