一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法技术

本发明专利技术公开了一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再将酵母磨碎，制成含N15的菌体蛋白粉末，利用含N15的菌体蛋白粉末取代常规的N14蛋白，用于培养多种线虫或线虫的共生菌体，为线虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记。本发明专利技术方法应用于线虫的蛋白质定量分析，操作简便，试验成本低，试验周期短，利于人们高效、低成本对大量样品进行蛋白质组分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质稳定同位素标记定量的
，尤其是指一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法。
技术介绍
生物体内蛋白质定量分析已成为研究蛋白质功能和寻求疾病蛋白标记物和药物靶标的重要途径。线虫(CaenorhabditisElegans)作为重要的模式生物之一，其体内蛋白质定量分析对生命科学研究意义重大。目前蛋白质定量技术主要是同位素代谢标记方法中的SILAC技术。SILAC(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)是哺乳动物细胞稳定同位素代谢标记技术，其基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。SILAC一般多用于组织培养细胞，在线虫上的应用始于英国邓迪大学的MarkLarance等人，他们修改了SILAC方法，通过使用一种重型赖氨酸和重型精氨酸标记的大肠杆菌喂养线虫，从而将这两种带有特异性标记的氨基酸带入线虫体内，他们还使用质谱分析，结果显示F1后代中已掺入重型精氨酸和赖氨酸。同时，为了避免精氨酸-普氨酸的转化造成的SILAC标记肽段信号降低，他们还采用RNAifeeding的方法，选定精氨酸-脯氨酸转化过程中必需的鸟氨酸转氨酶基因orn-1并将其沉默，从而降低精氨酸-脯氨酸的转化。质谱结果表明，这种方法几乎完全阻断了精氨酸-脯氨酸的转化,使后续SILAC实验可更高效地开展。然而上述改良的SILAC技术也有明显的局限性，其情况如下：1、操作繁琐。MarkLarance的SILAC定量流程包括：大肠杆菌培养并标记→蛋白提取→免疫沉淀→电泳分离→酶切消化→质谱检测→确定大肠杆菌被完全标记后，使用标记后的大肠杆菌培养线虫→线虫蛋白提取→免疫沉淀→电泳分离→酶切消化→质谱检测→定量检测，操作复杂，标记效率低，不方便实施。2、试验成本高。SILAC试剂价格昂贵，要得到足量的线虫，便需要大量的SILAC试剂，试剂成本十分高；而在试验中所需要的电泳和质谱检测等技术，无论是购买设备还是购买相关服务，都需要高额的费用。3、试验周期长。由于SILAC需要在进行培养的过程中添加标记，所以需要比较长的时间才能比较彻底地标记，一般来说，SILAC实验从开始到结束，包括数据分析，大约需要20到25天。而且上述试验还是多次标记，意味着要重复多次试验，处理步骤十分繁琐，所需时间也成倍增加。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，该方法可应用于线虫的蛋白质定量分析，操作简便，试验成本低，试验周期短，利于人们高效、低成本对大量样品进行蛋白质组分析。为实现上述目的，本专利技术所提供的技术方案为：一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再将酵母磨碎，释放菌体所含蛋白质，经提取纯化制成含N15的菌体蛋白粉末，利用含N15的菌体蛋白粉末取代常规的N14蛋白，用于培养多种线虫或线虫的共生菌体，为线虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记。本专利技术所提供的方案步骤如下：1)按照以下配方配制只含N15(不含N14)的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：2)使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基灭菌；3)待步骤2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在培养基中，放置在温度适宜的环境中培养；4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基进行离心。离心后舍去上清液，保留菌体沉淀；5)倒入适量的无菌生理盐水清洗菌体，离心，舍去上清液，得到酵母泥；6)酵母泥称重后，用无菌水配制成酵母液，使其自溶；7)自溶结束后，使用超声仪破碎细胞，然后在酵母液中加入微量蛋白酶进行酶解；8)酶解结束后，将酵母液加热灭酶活；9)将酵母液再次离心分离，得到上清液，舍去沉淀；10)酵母上清液先预冻，凝结成固体后，再放入冷冻干燥机中干燥得到N15酵母蛋白粉末；11)N15线虫饲料的配制：根据线虫的营养方式，选择不同的饲料配方。若所要培养的线虫能够直接从环境中摄取营养物质，可将步骤10)中制成的N15酵母蛋白粉末作为饲料的基本原料，取代常规的N14蛋白用于培养，再加入不含N的无机盐物质，制成最终的N15线虫饲料；若所要培养的线虫需要共生菌体或摄食微生物，则可用步骤10)中制成的N15酵母蛋白粉末制成微生物培养基，培养出含N15特异性标记的微生物，再以此为线虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记。在步骤3)中，酵母将培养基中的N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，而实际操作中根据最终配制的线虫饲料选择不同的酵母菌和只含N15的无机培养基配方。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：1、操作简单。本专利技术中涉及的操作都相对简单且容易上手，操作者经简单培训便可完成整个流程。2、试验成本低。本专利技术所用试剂和材料大多是普通试剂和材料，成本低；本专利技术所使用的设备简单易得，无需专人操作，节省了高昂的设备费用及人工成本。3、试验周期短。本专利技术中提及的方法标记效率高，且可以多批次同时进行，大大提高了效率，节省时间，一般来说，实验从开始到结束，包括数据分析，大约需要8到15天。具体实施方式下面结合多个具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1(N15绕线虫饲料的制备)本实施例所述的用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，具体是N15稳定同位素标记线虫饲料的制备方法，包括以下步骤：1)按照以下配方配制只含N15(不含N14)的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：2)使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基灭菌；3)待步骤2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在培养基中，放置在温度适宜的环境中培养；4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基进行离心。离心后舍去上清液，保留菌体沉淀；5)倒入适量的无菌生理盐水清洗菌体，离心，舍去上清液，得到酵母泥；6)酵母泥称重后，用无菌水配制成酵母液，使其自溶；7)自溶结束后，使用超声仪破碎细胞，然后在酵母液中加入微量蛋白酶进行酶解；8)酶解结束后，将酵母液加热灭酶活；9)将酵母液再次离心分离，得到上清液，舍去沉淀；10)酵母上清液先预冻，凝结成固体后，再放入冷冻干燥机中干燥得到N15酵母蛋白粉末；N1绕线虫饲料的配制：绕线虫可直接从环境中摄取营养物质，使用葡萄糖酵母蛋白培养基，制备方法如下：称取1～3g的葡萄糖，用20～40ml蒸馏水溶解；另外取1～2g的N15酵母蛋白粉末,用20～40ml蒸馏水溶解。将溶解后的液体灭菌后，两种液体等体积混合，放入冰箱(4℃)中保存，使用前用超声波振荡器处理5分钟。将培养基倒入培养皿中，液面高度约为1cm，加入绕线虫，将培养皿置于恒温培养箱中培养绕线虫，每天定时观察绕线虫的生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再将酵母磨碎，制成含N15的菌体蛋白粉末，利用含N15的菌体蛋白粉末取代常规的N14蛋白，用于培养多种线虫或线虫的共生菌体，为线虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记；其包括以下步骤：1)按照以下配方配制只含N15的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：2)使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基灭菌；3)待步骤2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在培养基中培养；4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基进行离心，离心后舍去上清液，保留菌体沉淀；5)倒入无菌生理盐水清洗菌体，离心，舍去上清液，得到酵母泥；6)酵母泥称重后，用无菌水配制成酵母液，使其自溶；7)自溶结束后，使用超声仪破碎细胞，然后在酵母液中加入蛋白酶进行酶解；8)酶解结束后，将酵母液加热灭酶活；9)将酵母液再次离心分离，得到上清液，舍去沉淀；10)酵母上清液先预冻，凝结成固体后，再放入冷冻干燥机中干燥得到N15酵母蛋白粉末；11)N15线虫饲料的配制：根据线虫的营养方式，选择不同的饲料配方，若所要培养的线虫能够直接从环境中摄取营养物质，则将步骤10)中制成的N15酵母蛋白粉末作为饲料的基本原料，取代常规的N14蛋白用于培养，再加入不含N的无机盐物质，制成最终的N15线虫饲料；若所要培养的线虫需要共生菌体或摄食微生物，则能够用步骤10)中制成的N15酵母蛋白粉末制成微生物培养基，培养出含N15特异性标记的微生物，再以此为线虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记。...

【技术特征摘要】
1.一种用于线虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再将酵母磨碎，制成含N15的菌体蛋白粉末，利用含N15的菌体蛋白粉末取代常规的N14蛋白，用于培养多种线虫或线虫的共生菌体，为线虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记；其包括以下步骤：1)按照以下配方配制只含N15的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：2)使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基灭菌；3)待步骤2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在培养基中培养；4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基进行离心，离心后舍去上清液，保留菌体沉淀；5)倒入无菌生理盐水清洗菌体，离心，舍去上清液，得到酵母泥；6)酵母泥称重后，用无菌水配制成酵母液，使其自溶；7)自溶结束后，使用超声仪破碎细胞，然后在酵母液中加入蛋白酶进行酶解；8)酶解结束后，将酵母液加热灭酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖传乐，陈龙，
申请(专利权)人：广州微因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44