本发明专利技术涉及一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。采用的技术方案是：１）酿酒酵母细胞的活化；２）抗朊病毒药物的初筛选：将待测药物、ＹＰＤ液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，振荡培养１～５天，通过菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；３）使用ＳＤＤ－ＡＧＥ／Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ的方法，定量检测抗朊病毒药物的作用效果；４）用全自动图像分析系统Ｄｏｌｐｈｉｎ－ＤＯＣ进行图像扫描，分析。本发明专利技术可精确地在蛋白质水平通过检测细胞内朊病毒蛋白聚集体的可溶性变化来评估药物的作用效果；通过定量检测朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，完成在蛋白质的水平上判断药物对朊病毒的作用大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在酵母细胞中检测抗朊病毒药物作用效果的方法，特别涉及一种 在蛋白质水平的精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。
技术介绍
朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁 病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。关于 朊病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发的研究是国际上生物学、医学领域研究的前 沿和热点。目前国际上一般使用SDS-PAGE/Western Blot来在蛋白质水平通过检测细胞内 朊病毒蛋白聚集体的可溶性的变化来评估抗朊病毒药物的作用效果，这种方法首先通过高 速离心将细胞内可溶状态的单体朊蛋白与不可溶状态的聚集体朊蛋白分开，然后分别进行 SDS-PAGE/Western Blot，从而通过条带的有无以及条带亮度来判断细胞内的朊病毒的聚 集状态。尽管这是一种行之有效的方式，但是使用这种方法不能够定量测定朊病毒蛋白聚 集体的分子量大小的变化。而朊病毒蛋白聚集体的分子量大小是其致病性、传染性的根本 原因，其聚集体的分子量大小的变化是抗朊病毒药物作用效果的重要指标。因此，尤其是在 基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选中，需要一种更为有效的方法来对药物的作用效果进行 精确地检测与评估。
技术实现思路
针对国际上不能够定量测定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化的不足，本发 明提供一种新型的采用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质印迹的方法(SDD-AGE/Western blot)，用琼脂糖凝胶电泳来定量检测朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，以解决测定 朊病毒蛋白聚集体的分子量大小方面的技术问题。本专利技术使用的菌种为野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)，来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection, ATCC)，保藏编号 为208719。这种野生型酿酒酵母细胞带有朊病毒，即Sup35p呈聚集状态，表现为 较大的分子量，菌落颜色表现为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，不同的药物促进 Sup35p聚集体解聚的能力不同，从而表现出不同的分子量，菌落的颜色也随着聚集体的变 化而变化——Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次 表现为白色，粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的 分子量(约为74kDa)，菌落颜色表现为红色，称为[psil细胞。本专利技术采用的技术方案是一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效 果的方法，其步骤如下1)酿酒酵母细胞的活化取酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)接入 YPD 液体培养基中，30°C水浴振荡培养18h，然后进行酵母菌初始0D值的调试，调制菌悬液0D, = 0.5；2)抗朊病毒药物的初筛选取无菌冻存管，加入待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬 液，在24°C的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的酿酒酵母细胞放入新的装有 YPD液体培养基和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1 5天，每天取菌悬液少量稀释涂 平板到1/2YPD固体培养基上，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；Sup35p呈聚集状态时，朊病毒蛋白聚集体表现为较大的分子量，菌落颜色表现 为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化—— Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色， 粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约 为74kDa)，菌落颜色表现为红色。3)定量检测抗朊病毒药物的作用效果酿酒酵母细胞裂解液的制备取经药物治疗不同时间后稀释涂平板在1/2YPD上 长出的单菌落，按菌落颜色分组，每组挑取3-5个单菌落接种到10ml YPD液体培养基中活 化18h，然后再以的接种量接种到50mlYPD液体培养基中扩大培养12h，离心收集细胞， 然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；琼脂糖凝胶电泳用含0. 1 %十二烷基硫酸钠(SDS)的TBE配制1. 5%琼脂糖凝 胶，用含0. 5% SDS的上样缓冲液于42°C温育蛋白样品lOmin，然后将蛋白样品在100V，4°C 的条件下电泳至凝胶前沿，再将蛋白湿法电转移到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，并曝光X 光片获得图像信息；4)用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析。本专利技术中，朊病毒被治愈的酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)中Sup35p呈单体可溶状态，未被治愈的细胞中Sup35p聚集在一起形成聚合物。通 过细胞中Sup35p聚集体分子量的大小变化，可以在蛋白质水平精确定量检测待测药物对 朊病毒聚集体的作用效果。本专利技术的有益效果是本专利技术，采用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质印迹的方 法(SDD-AGE/Western blot)，相对于国际上一般使用的SDS-PAGE/Western Blot方法，能够 更加精确地在蛋白质水平通过检测细胞内朊病毒蛋白聚集体的可溶性的变化，依此来评估 抗朊病毒药物的作用效果。由于，朊病毒蛋白聚集体的分子量大小是其致病性、传染性的根 本原因，其聚集体的分子量大小的变化是抗朊病毒药物作用效果的重要指标，而本专利技术通 过SDD-AGE/Western blot方法能够精确的确定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，从 而实现在蛋白质水平定量判断药物对朊病毒的作用效果，并在分子机理和细胞学上探讨抗 朊病毒药物的作用机理。本专利技术采用湿法电转移的方法将经凝胶电泳的蛋白转移到PVDF 膜上，该法与虹吸法相比可以节约80%以上的时间，同时它也克服了半干法电转蛋白转移 不完全的缺点。附图说明图1是实施例1中，利用SDD-AGE/Western Blot方法检测、的照片；图2是实施例2中，利用SDD-AGE/Western Blot方法检测盐酸胍对朊病毒4作用效果的照片。图3是实施例3中，利用SDD-AGE/Western Blot方法检测菲啶对朊病毒作 用效果的照片。具体实施例方式菌种来源Sf生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC208719)，来自 于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为 208719。实施例1定量检测、、 菌株单菌落，分别接种到10ml YPD液体培养基中，30°C水浴振荡培养18h。然后用 YPD进行酵母菌初始0D值的调试，调制菌悬液终浓度0D_ = 0.5；以的接种量将调试好的、分别接种到50ml YPD液体培养基中， 30°C，180转振荡培养约12h，到0D_ = 1. 5左右时停止培养。2)采用 SDD-AGE/Western blot 的方法，定量检测、、[psil酵母菌培养液分 别离心，5000rpm，5min，去上清收集细胞，加入裂解缓冲液(25mM Tris-C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其特征在于步骤如下：１）酿酒酵母细胞的活化：取酿酒酵母细胞（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＴＣＣ２０８７１９）接入ＹＰＤ液体培养基中，３０℃水浴振荡培养１８ｈ，然后进行酵母菌初始ＯＤ值的调试，调制菌悬液ＯＤ↓［６００］＝０．５；２）抗朊病毒药物的初筛选：取无菌冻存管，加入待测药物、ＹＰＤ液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，在２４℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的酿酒酵母细胞放入新的装有ＹＰＤ液体培养基和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养１～５天，每天取菌悬液少量稀释涂平板到１／２ＹＰＤ固体培养基上，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；３）定量检测抗朊病毒药物的作用效果：酿酒酵母细胞裂解液的制备：取２）步中，经药物治疗不同时间后稀释涂平板在１／２ＹＰＤ上长出的单菌落，按菌落颜色分组，每组挑取３－５个单菌落接种到１０ｍｌＹＰＤ液体培养基中活化１８ｈ，然后再以１％的接种量接种到５０ｍｌＹＰＤ液体培养基中扩大培养１２ｈ，离心收集细胞，然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；琼脂糖凝胶电泳：用含０．１％ＳＤＳ的ＴＢＥ配制１．５％琼脂糖凝胶，用含０．５％ＳＤＳ的上样缓冲液于４２℃温育蛋白样品１０ｍｉｎ，然后将蛋白样品在１００Ｖ，４℃的条件下电泳至凝胶前沿，再将蛋白湿法电转移到ＰＶＤＦ膜上，进行免疫印迹反应，并曝光Ｘ光片获得图像信息；４）用全自动图像分析系统Ｄｏｌｐｈｉｎ－ＤＯＣ进行图像扫描，分析。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋有涛，兰万军，宋尧，李辉，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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