本发明专利技术提供了一种以检测冷光或荧光信号变化为基础来确定任何一个乃至所有ＤＮＡ结合因子、蛋白质或其片段的活性的方法。优选的是，将荧光供体附在一个含有ＤＮＡ结合元件其中一部分的核酸上，并将荧光受体附在一个含有相同Ａ结合元件其它部分的核酸上。或者，将一个微球体附在一个含有结合元件其中一部分的核酸上，并将一个冷光团或者荧光染料附在一个含有相同结合元件其它部分的核酸上。ＤＮＡ结合因子和核酸组分结合时，会影响冷光的变化。这些方法也可以用来检测调结分析物，诊断疾病和／或筛选介导ＤＮＡ结合因子活性的药物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
政府支持此项研究工作获得美国健康和人类服务工作部门/国家健康机构(U.S.Department of Health and Human Services/National Institutes of Health)的支持，补助金批准编号是GM50514。美国政府对本专利技术具有一定的权利。序列表一份书面拷贝的序列表，和一份相同的计算机可读形式的序列表，附在下以供参考。根据37C.F.R.1.821(f)，机读形式清单和笔写书面清单中所纪录的信息，是完全相同的。
技术介绍
1.专利
大体而言，本专利技术涉及一种通过检测荧光素标记的强度变化，或者一个颜色计量底物的颜色变化来检测和定量特异性蛋白质的方法，尤其是检测和定量序列一特异性DNA结合蛋白质的方法。本专利技术可以应用在任何需要检测和定量一个DNA结合蛋白质的DNA活性的地方。2.相关技术的描述检测和定量特异性-蛋白质分子，在基础研究和临床应用中非常重要。在生物医学研究和分子诊断中，测定特异性蛋白质的量是最有用而且最重要的实验程序之一。许多疾病普遍使用特异性蛋白质在细胞内的量作为诊断标记。蛋白质-核酸的相互作用乃是在细胞中所发现的一种极其重要且与生理相关连的生物大分子之间的接触。许多在调节细胞生理过程中扮演重要角色的蛋白质，具有天然的序列-特异性DNA结合活性。这些蛋白质包括转录因子，染色质重建因子以及脱氧核搪核酸(DNA)维持酶。DNA结合蛋白质的综合报告，请参阅Benjamin Lewin，Genes VII，牛津大学出版社，纽约，2000年，特此提出以供参考。转录因子结合到特定同源核酸元件上，这些元件包括启动子，增强子和沉默元件。这些转录因子根据细胞内的其它物质，可以是活化因子，抑制因子，或者两者皆是。这些因子的量对基因表达的调控很重要。因此，许多这些蛋白质对疾病的发展和诊断十分重要。例如，有几种转录因子，当它们超量表达或不正确的表达时，就变成癌基因。这些癌荃因转录因子包括myc，myb，fos，jun，rel和erb。而很多种癌症的发展，都涉及到另外一个和癌症有关的转录因子，p53。(Ko，L.L.和Prives，C.Genes Dev.10，1054-1072，1996)。染色质重建因子对基因表达的调控也很重要。一般而言，高度浓缩的染色质区域，即异染色质，其所含的墓因没有转录活性，而松散或不浓缩的染色质区域，即常染色质，其所含的基因则有转录活性。在细胞分化，癌转化和正常生理上的稳定状态下，染色质可能被重塑。也就是说，染色质上的一些区域变得不易于转录因子和RNA聚合酶的接近，而另一些区域则变的更易于转录因子和核搪核酸(RNA)聚合酶的接近。有数种DNA结合因子参与了这个动力十足的过程，其中包括核小体蛋白质(如组蛋白)，组蛋白氨酞转移酶，组蛋白脱氨酞酶，氨基酸甲基转移酶，核糖核酸甲基转移酶，核质素，HMG蛋白质，抑制复合蛋白质，多梳状(polycomb)-相关因子，以及三甲(trithorax)-相关因子。DNA维持酶乃是在修复损伤DNA，忠实复制DNA，以及在重组过程中交换遗传信息不可或缺的DNA结合蛋白质。好几种类型的癌症和其他疾病的症状都是由DNA维持酶的缺乏所导致的。例如，着色性干皮病，这是一种十分可怕的遗传病，它的患者易于患皮肤癌，而该病就是由于缺乏核甘-切除修复酶所导致的。遗传性的非息肉病结肠直肠癌很大部分是由于欠缺错配修复酶所导致的。某些遗传性的乳腺癌则是由于欠缺同源重组酶所导致的。关于基因组的维持系统及它们在癌症上的作用，请参阅Hoeijmakers，J.H.J.，Nature 411，366-374，2001年，特此提出以供参考。因此，使用一种简便、准确的方法去检测、监视和/或定量DNA结合蛋白质的DNA结合活性，实乃具有非常重要的意义。在检测蛋白质所展现的序列一特异性DNA结合能力的方法当中，最常用的方法是凝胶移位分析和各种DNA印记分析法(Fried，M.Ca和Crothers，D.M.NucleicAcid Res.9，6505，1981；Galas，D.J.和Schmitz，A.Nucleic Acid Res.5，3157-3170，1978)。这些方法不但很费力而且很费时，特别是它们还得使用既危险又昂贵的放射性元素。更重要的是，这些方法不能普遍的应用于高生产量的分析模式中。数种不同的以荧光素为基础，用来检测和研究DNA结合蛋白质的方法已经被研发出来，以克服凝胶移位分析和DNA印记分析法所具有的缺陷。与其他的检测法相比，用荧光来检测分子具有几个重要优点。荧光具有无可匹敌的检测灵敏度，用荧光来检测单一分子的例子便可充分展示这一特点。(Weiss，S.Science 283，1676-1683，1999)。荧光的检测，荧光强度的变化，或者发光谱的变化，均可轻易的通过选择特定的激发和发射波长来完成。由于荧光提供的是实时的信号，因此可以用显微镜来进行实时的过程监测和实时的细胞成像(参阅Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，KluwerAcademic/Plenum出版社，纽约，1999，特此提出以供参考)。另外，既有的非常完善的方法和仪器，可以完成高生产量荧光信号的检测。目前用荧光来检测溶液中DNA结合蛋白质的方法，得依赖下列几个现象之一(i)某种荧光染料(也叫荧光团或荧光探针或荧光标记)的荧光强度的变化，这种荧光染料可以出现在蛋白质里也可以出现在DNA中，这种荧光强度的改变是由探针对蛋白质-DNA复合物形式的微环境的干扰所引起的；(ii)该种荧光染料之荧光极性的变化，是由于蛋白质-DNA复合物分子的尺寸，相对于未结合的DNA或蛋白质分子而言增大许多而造成的，这种荧光染料可以出现在蛋白质里也可以出现在DNA中；以及(iii)DNA上荧光染料和蛋白质上荧光染料之间的共振能量转移，这个现象是由在DNA-蛋白质复合物上的DNA和蛋白质彼此太接近所引起的。荧光信号检测法的综述，请参阅Hill，.J.J.和Royer，C.A.Methods in Enzymol.278，390-416(1997)，特此提出以供参考。在第一种(i)方法中，荧光信号的变化是山荧光探针在一个蛋白质-DNA复合物形成时，其微环境的变化所引起的。由于荧光信号变化的产生，仰赖的是下述这个不可预料的特性，亦即一个蛋白质-DNA复合物的形成，会使得荧光探针环境改变到足以产生一个可以被检测到的荧光变化，因此这种方法并不适用于所有状况，它在某些状况下可行，在某些状况下不可行。这种分析方法的结果，端视DNA属性、DNA序列、DNA片段的长度、所使用的荧光探针、荧光探针与DNA的结合方式而定。因此，几乎不可能预测这种方法在何种状况下可行，在何种状况下不可行，这是因为由探针环境变化所引起的荧光强度变化的机械结构，尚不十分清楚的缘故。用这种方法将荧光染料结合在蛋白质或DNA上来检测蛋白DNA复合物的应用例子，请参阅下列技术文献Sha.M，，Ferre-D′Amare，Burley，S.K，Goss，D.J.J.Biol.Chem.270，19325-19329，1995；Reedstrom R.J.，Brown本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种确定样品中ＤＮＡ结合因子活性的方法，其特征在于，所述方法包括使两种核酸组分与样品结合，其中，（ａ）每个核酸组分都含有ＤＮＡ结合元件的一部分，当两种核酸组分结合在一起时就组成一个完整的ＤＮＡ结合元件，（ｂ）其中一个核酸组分 被荧光供体标记，另一个核酸组分被荧光受体标记，以及（ｃ）通过以距离效应为墓础的冷光检测法来检测包含在样品中的一个或多个ＤＮＡ结合因子与ＤＮＡ结合元件之间的结合。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：T海普克，
申请(专利权)人：圣路易大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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