检测目标物多个表位的生物感应器制造技术

此项发明专利技术包含检测含一个重复性表位之目标物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测目标物多个表位的生物感应器管辖权此项专利技术获国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health)依 R41GM079891 提供政府资助。政府对此项专利技术持有特定权利。
技术介绍
致病菌可引发五十种以上的感染性疾病。检测临床、食物、水和环境样本中所含致原菌的方法，对感染性疾病的诊断、治疗和预防至关重要。现有的病原体检测法包括以细胞培养和菌落计数为基础的传统检测法、抗原检测法、聚合酵素链锁反应(PCR)法，及各种生物感应器。每种方法各有优缺点。传统检测法虽然健全而灵敏，但速度非常缓慢；抗原检测法和PCR法尽管速度较快，但需具备技术，而且PCR法很容易出现伪阳性；生物感应器很有希望大幅缩短检测时间，但还需更多发展才能实际派上用场。目前显然需要能克服现有技术限制的新检测法。专利技术摘述此项专利技术其中一部分，包含一种检测至少含一个重复性表位(i^peating epitope)之目标物的方法。此种方法需以分子生物感应器接触含目标物的样本。此生物感应器包含R1-R2-R3-R4 ；与R5-R6-R7-R8 ；其中Rl和R5为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R2为连接Rl及R3的弹性连结元(flexible linker)R3 和 R7 是一对互补核甘酸序列(complementary nucleotide sequences)，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole 左右白勺连结自由能(free energy for association)；R4和R8共同组成一种检测工具，当R3和R7连结时就会产生可检测到的信号；R6为连接R5及R7的弹性连结元。下文将更详细说明此项专利技术的其它层面和迭代法。彩色图片说明申请档案内含至少一张彩色图片。只需要求并支付必要费用，本营业处就会提供含彩色图片的专利权申请书副本。图示简述图I(A)所示为分子生物感应器的设计。ANTIl和ANTI2是以信号寡核甘酸 (signaling oligonucleotides)标注的抗体；T是目标物蛋白质。附图说明图1 (B)所示为分子生物感应器的原理验证。黑线以荧光素(fluorescein)标注的20nM ANTIl发射光谱。红线 以Cy5标注的20nM ANTIl与25nM ANT12混合物发射光谱。蓝线当与20nM的人类I型心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I)同时出现时，20nM ANTIl与25nM ANTI2混合物发射光谱。激发点为490nM。插页各样本的荧光共振能量转移(fluorescent resonance energytransfer, FRET)信号(发射点为670nm，激发点为490nm)。图1 (C)为低蛋白质浓度时的心肌肌钙蛋白感应器反 应。图2所示为检测病原体的抗体感应器设计。图3(A)所示为抗体优先结合(preferential binding)机制，以互补信号寡核甘酸(complementary signaling oligonucleotide)标注相邻抗体。图 3(B)为原理验证， 证明图2所示的感应器设计确实可行。呈现含等摩尔标注抗体(与指定数量的目标细胞 或阴性对照细胞 —起培养)混合物的96孔微量分析盘中，伪色荧光影像的盘孔。上图是发射点为520nm(激发点为488歷)的影像，下图是发射点为670nm(激发点为488nm)的影像。图4所示为20nM/25nM抗体(在指定数量的细胞上，以荧光素和Cy5修饰互补信号寡核甘酸标注)混合物所产生的FRET信号。图中呈现3次独立测量结果的平均值和标准差。黑色符号为0157:H7型大肠杆菌(E.coli)；蓝色符号为K12型大肠杆菌。图5所示为0157:H7型大肠杆菌细胞(与以荧光素修饰信号寡核甘酸标注的抗体 ，或以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注的抗体混合物一起培养)的荧光共焦显微影像。所拍摄的荧光素影像激发点为488nm，发射点为520nm。FRET 影像的激发点为488nm，发射点为670nm。图6所示为生物感应器反应的动力学。在20nM的抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物中，加入指定数量的0157 :H7型大肠杆菌细胞，并监测FRET信号 (发射点为670nm，激发点为488nm)的时间变化。图7所示为抗体浓度较低时，目标细胞的检测灵敏度增加。黑色符号10/12nMnM 抗体混合物；蓝色符号5/6. 2nM nM抗体混合物。图8所示为用来提高少量细菌检测率的样本浓缩步骤。红色长条图浓度为 3000cells/ml的样本；蓝色长条图浓度为300，000cells/ml的样本。图9所示为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)的生物感应器。利用在指定数量细胞(201分析液，384孔微量分析盘)中的20nM/25nM抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物，产生FRET信号。图中呈现3次独立测量结果的平均值和标准差。黑色符号鼠伤寒沙门氏菌；青绿色符号K12型大肠杆菌；蓝色符号0157:Η7型大肠杆菌。图10所示为鼠伤寒沙门氏菌生物感应器反应的动力学。在20ηΜ/25ηΜ的抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物中，加入指定数量的沙门氏菌细胞，并监测 FRET信号(发射点为670nm，激发点为488nm)的时间变化。图11所示为均质性限制酶(homogenous restriction-enzyme)信号放大法，可与分子生物感应器的均质性性质兼容。Sl与S2所示为可辨识目标物的抗体(以短寡核甘酸标注)，这些抗体上的短寡核甘酸会与S3的限制酶切割位点区互补。图12所示为细菌检测感应器的固相表面(solid-surface)转化。将含多个序列复本(与用来标注抗体的信号寡核甘酸具互补作用)的寡核甘酸，固定在固相表面。图13为原理验证，证明图12所示设计确实有效。将不同数量的0157:H7型大肠杆菌与20nM的抗体(在内含已固定之互补寡核甘酸的微量分析盘盘孔中，与荧光素修饰信号寡核甘酸结合)一起培养，在以缓冲液冲洗盘孔后，盘式仪(Plate reader)就会读取残留在盘孔中的荧光。K12型大肠杆菌并未检测到信号(红色符号)。图14所示为TIRF固相表面细菌生物感应器的原理验证。将含多个序列复本(与用来标注抗体的信号寡核甘酸具互补作用)的寡核甘酸，固定在石英载玻片表面。监测 TIRF所诱发的荧光(源自载玻片表面)。将只含标注抗体的样本注入后，只能观察到少量信号；但若有目标细菌存在，就能观察到大量信号。图15为2条铁蛋白分析(ferritin assay)的标准曲线。详述此项专利技术此项专利技术是以分子生物感应器的利用方法为导向。尤其特别的是，其中包含可检测含重复性表位之目标物的方法。此种方法通常涉及二个表位结合体(印itope-binding agent)的目标分子诱发性连结(target-molecule induced co-association),各个结合体均能辨识目标物上的同一个重复性表位。每个表位结合体均含互补信号寡核甘酸(以检测工具标注，并透过弹性连结元与表位结合体连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．检测含至少一个重复性表位之目标物的方法，此法包含将含目标物的样本与分子生物感应器接触，此生物感应器包含：Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４；与Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８；其中：Ｒ１和Ｒ５为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；Ｒ２为连接Ｒ１及Ｒ３的弹性连结元；Ｒ３和Ｒ７是一对互补核甘酸序列，在温度约２１℃至４０℃，且盐浓度约１ｍＭ至１００ｍＭ的环境下，具有５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ至８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ左右的连结自由能；Ｒ４和Ｒ８共同组成一种检测工具，当Ｒ３和Ｒ７连结时就会产生可检测到的信号；Ｒ６为连接Ｒ５及Ｒ７的弹性连结元；检测Ｒ３和Ｒ７连结所产生的信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·海杜克，
申请(专利权)人：圣路易大学，
类型：发明
国别省市：US