本发明专利技术公开了一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，通过同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术筛选早期心肌梗死疾病患病人群血清中差异表达的蛋白质，通过对两组标记后的血清样品的质谱结果进行单样本T检验分析，找到6个高表达的蛋白，1个为正常组中高表达，5个为早期心肌梗死疾病组中高表达。其中，在疾病组中Leucine‑rich alpha‑2‑glycoprotein蛋白覆盖度和唯一肽段数最高，通过肽段数据的分析证实其肽段也存在显著差异，经过基因本体功能注释分析发现此蛋白可能与血栓形成等过程相关。本发明专利技术方法具有分辨率高、通量大、速度快等优势，为此类疾病蛋白标志物的筛选开辟了一条新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测
，具体是一种同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法。
技术介绍
心肌梗死(myocardial infarction MI)即心肌缺血性坏死，为在冠状动脉病变的基础之上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断使得心肌严重而持久的缺血导致心肌坏死。此疾病具有发病急，不易察觉，病残病死率高等特点。目前心肌梗死患者呈现快速上升趋势，估计每年有250万例心肌梗死的发生，然而只有5％的患者得到及时合理的救治。因此开发出一种早期快速的诊断试剂对疾病的早期防治和降低疾病病发率，减少疾病的病残病死率有着最重要意义。现代临床诊断心肌梗死疾病主要通过肌钙蛋白(CTnI)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、肌红蛋白(Myo)等生化标志物并结合心电图和影像学等证据。但这些生化标志物仅在病发时才能表现出异常，而在疾病早期并无明显变化。因此，寻找新的早期诊断标志物可以提前对此疾病进行防治，减少此类疾病的发生和发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术首次通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolutequantification，iTRAQ)蛋白质组学技术筛选在心肌梗死疾病中的差异表达的蛋白质，为此类疾病标志物的筛选开辟了一条新的途径，为开发心肌梗死疾病的早期诊断试剂提供重要理论依据。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，包括以下步骤：(1)取正常组与心肌梗死疾病组血清，组内随机合并，将合并后样品使用去人血清高丰度柱依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，进行蛋白质定量，将制备好的蛋白质样品进行分装，-80℃保存备用；(2)取2组8个蛋白质样本各取250μg，各组加入等体积的蛋白质裂解液，沸水浴4～6min，冷却至室温；加入200μL尿素缓冲液混匀，转入10kd超滤离心管，离心14～16min；加入200μL尿素缓冲液离心14～16min，弃滤液；加入100μL碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡1min，避光室温25～35min，离心9～11min；加入100μL尿素缓冲液，离心9～11min重复2次；加
入100μL 标记缓冲液，离心9～11min，重复2次；加入40μL胰蛋白酶缓冲液，600rpm振荡1min，37℃16～18h；换新收集管，离心9～11min，取滤液，OD280肽段定量；(3)取等量的肽段进行同位素标记，标记方案如下：正常组1-113，正常组2-114，正常组3-115，正常组4-116，疾病组1-117，疾病组2-118，疾病组3-119，疾病组4-121；(4)分别取所有标记样品合并，合并样品进行离子交换色谱柱分级，收集穿流及洗脱，根据离子交换色谱柱色谱图合并，冻干后C18脱盐柱脱盐；(5)样品采用纳升流速高效液相系统进行分离，上样量为5μL，缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈为84％，色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为400nL/min，相关液相梯度如下：0～100min，B液线性梯度从0～35％；100～108min，B液线性梯度从35～100％；108～120min，B液维持在100％；样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析，分析时长120min，检测方式正离子，母离子扫描范围300～1800m/z，一级质谱分辨率70000at m/z 200，进入离子阈值：3e6，一级最大灌注时间20ms，扫描范围数量：1，动态排除时间：40.0s；多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2scan)，MS2碎裂方式：高能碰撞裂解，分离度窗口：2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，微扫描：1，二级最大灌注时间：60ms，碰撞能量：27eV；(6)将得到的数据，进行数据处理。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(2)中，所述尿素缓冲液为8M尿素、150mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合物，pH为8.0。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(2)中，所述碘乙酰胺为50mM碘乙酰胺溶液。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤(2)中，所述胰蛋白酶缓冲液为5μg胰蛋白酶溶解于40μL的标记缓冲液。本专利技术的原理为：通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolutequantification，iTRAQ)蛋白质组学技术筛选早期心肌梗死疾病患病人群血清中差异表达的蛋白质。通过对两组标记后的血清样品的质谱结果进行单样本T检验分析，找到6个高表达的蛋白(ratio>2)，1个为正常组中高表达，5个为早期心肌梗死疾病组(以下简称疾病组)中高表达。其中，在疾病组中Leucine-rich alpha-2-glycoprotein蛋白覆盖度和唯一肽段数最高，通过肽段数据的分析证实其肽段也存在显著差异。经过基因本体功能注释分析发现此蛋白可能与血栓形成等过程相关。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：具有分辨率高、通量大、速度快等优势，为此
类疾病蛋白标志物的筛选开辟了一条新的途径。附图说明图1为实施例1中正常组与疾病组定量比值分布；图2为实施例1中Leucine-rich alpha-2-glycoprotein蛋白鉴定得到的17个肽段中vFSNGADLSGVTEEAPLk肽段的二级质谱图；图3为实例1中Leucine-rich alpha-2-glycoprotein蛋白鉴定到的肽段在正常组与疾病组中比值分布图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1血清蛋白质样品的制备本实施例中所使用的去人血清高丰度柱(Agilent H-14)购自安捷伦公司；二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均购自伯乐公司。本实施例使用Agilent H-14依次去除样品中存在的高丰度蛋白质，并通过超滤浓缩的方法对低丰度蛋白质组分进行浓缩。具体如下：取正常组与心肌梗死疾病组(以下简称疾病组)血清各35例，组内随机合并成4例。将合并后样品使用Agilent H-14依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，Bradford蛋白定量试剂盒(伯乐)进行蛋白质定量。制备好的蛋白质样品进行分装，-80℃保存备用。实施例2运用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术进行正常组与心肌梗死疾病组差异表达蛋白质的筛选本实施例中所使用尿素(urea)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、碘乙酰胺(IAA)购自伯乐公司；胰蛋白酶(Trypsin)购自Sigma公司；标记试剂盒iTRAQ Reagent-8plex 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取正常组与心肌梗死疾病组血清，组内随机合并，将合并后样品使用去人血清高丰度柱依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，进行蛋白质定量，将制备好的蛋白质样品进行分装，‑80℃保存备用；(2)取2组8个蛋白质样本各取250μg，各组加入等体积的蛋白质裂解液，沸水浴4～6min，冷却至室温；加入200μL尿素缓冲液混匀，转入10kd超滤离心管，离心14～16min；加入200μL尿素缓冲液离心14～16min，弃滤液；加入100μL碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡1min，避光室温25～35min，离心9～11min；加入100μL尿素缓冲液，离心9～11min重复2次；加入100μL标记缓冲液，离心9～11min，重复2次；加入40μL胰蛋白酶缓冲液，600rpm振荡1min，37℃16～18h；换新收集管，离心9～11min，取滤液，OD280肽段定量；(3)取等量的肽段进行同位素标记，标记方案如下：正常组1‑113，正常组2‑114，正常组3‑115，正常组4‑116，疾病组1‑117，疾病组2‑118，疾病组3‑119，疾病组4‑121；(4)分别取所有标记样品合并，合并样品进行离子交换色谱柱分级，收集穿流及洗脱，根据离子交换色谱柱色谱图合并，冻干后C18脱盐柱脱盐；(5)样品采用纳升流速高效液相系统进行分离，上样量为5μL，缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈为84％，色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为400nL/min，相关液相梯度如下：0～100min，B液线性梯度从0～35％；100～108min，B液线性梯度从35～100％；108～120min，B液维持在100％；样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析，分析时长120min，检测方式正离子，母离子扫描范围300～1800m/z，一级质谱分辨率70000at m/z 200，进入离子阈值：3e6，一级最大灌注时间20ms，扫描范围数量：1，动态排除时间：40.0s；多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2scan)，MS2碎裂方式：高能碰撞裂解，分离度窗口：2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，微扫描：1，二级最大灌注时间：60ms，碰撞能量：27eV；(6)将得到的数据，进行数据处理。...
【技术特征摘要】
1.一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取正常组与心肌梗死疾病组血清，组内随机合并，将合并后样品使用去人血清高丰度柱依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，进行蛋白质定量，将制备好的蛋白质样品进行分装，-80℃保存备用；(2)取2组8个蛋白质样本各取250μg，各组加入等体积的蛋白质裂解液，沸水浴4～6min，冷却至室温；加入200μL尿素缓冲液混匀，转入10kd超滤离心管，离心14～16min；加入200μL尿素缓冲液离心14～16min，弃滤液；加入100μL碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡1min，避光室温25～35min，离心9～11min；加入100μL尿素缓冲液，离心9～11min重复2次；加入100μL标记缓冲液，离心9～11min，重复2次；加入40μL胰蛋白酶缓冲液，600rpm振荡1min，37℃16～18h；换新收集管，离心9～11min，取滤液，OD280肽段定量；(3)取等量的肽段进行同位素标记，标记方案如下：正常组1-113，正常组2-114，正常组3-115，正常组4-116，疾病组1-117，疾病组2-118，疾病组3-119，疾病组4-121；(4)分别取所有标记样品合并，合并样品进行离子交换色谱柱分级，收集穿流及洗脱，根据离子交换色谱柱色谱图合并，冻干后C18脱盐柱脱盐；(5)样品采用纳升流速高效液相系统进行分离，上样量为5μL，缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，阮宏强，王健，孙晓斌，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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