【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RAS-RAF-MAPK通路蛋白的检测和量化相关申请的交叉引用本申请要求2017年2月28日提交的美国临时申请第62/465,102号的权益和优先权，其通过引用以其整体并入用于任何目的。序列表本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用以其整体在此并入。所述ASCII副本，创建于2018年2月22日，命名为2018-02-22_01129-0062-00PCT_Seq_List_ST25，且大小为485千字节。
本公开涉及通过免疫沉淀和质谱法来检测和量化包含邻近通路蛋白的RAS-RAF-MAPK通路蛋白的领域。
技术介绍
RAS-RAF-MAPK和AKT-mTOR信号通路是正常细胞生长和恶性转化的若干方面的关键调节剂，如细胞存活、分化、增殖、代谢和响应细胞外信号的运动性。这两种通路进行广泛串扰，以便两者相互正面和负面地调节。由于其在癌症中的重要性，RAS-MAPK通路靶标在过去二十年中一直是药物靶向的焦点。靶向RAS通路的关键调节剂的合理疗法可能抑制肿瘤生长、存活和扩散。参见MendozaMC；ErEE；BlenisJ.；《生物化学趋势(TrendsBiochemSci.)》2011Jun；36(6):320-8。检测和量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的主要限制是缺少严格验证的方法和试剂。目前，仅可使用来自蛋白质印迹、ELISA以及Luminex测定的半量化结果。质谱法(MS)逐渐成为选择用于测定蛋白质丰度和转译后修饰的检测方法。然而，迄今为止，MS还未成功量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白，可能是由于它们的低丰度和大量的转...
【技术保护点】
1.一种用于检测RAS‑RAF‑MAPK通路蛋白的方法，其包括：a.用至少一种抗体处理生物样品，所述抗体能够使来自生物样品的RAS‑RAF‑MAPK通路蛋白发生免疫沉淀；b.消化经过免疫沉淀的所述靶蛋白；c.通过质谱分析经过消化的所述蛋白质，以确定RAS‑RAF‑MAPK通路蛋白的肽的存在或不存在，其中RAS‑RAF‑MAPK通路蛋白的所述肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:1400的序列并且长度小于或等于40个氨基酸；以及d.检测所述样品中的一种或多种RAS‑RAF‑MAPK通路蛋白。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.28 US 62/465,1021.一种用于检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：a.用至少一种抗体处理生物样品，所述抗体能够使来自生物样品的RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀；b.消化经过免疫沉淀的所述靶蛋白；c.通过质谱分析经过消化的所述蛋白质，以确定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的存在或不存在，其中RAS-RAF-MAPK通路蛋白的所述肽包括SEQIDNO:1至SEQIDNO:1400的序列并且长度小于或等于40个氨基酸；以及d.检测所述样品中的一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量。3.一种用于检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：a.从生物样品分离蛋白质；b.消化经过分离的所述蛋白质；c.通过质谱分析经过消化的所述蛋白质，以确定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的存在或不存在，其中RAS-RAF-MAPK通路蛋白的所述肽包括SEQIDNO:1至SEQIDNO:1400的序列，其中所述肽的长度小于或等于40个氨基酸；以及d.检测所述样品中的一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白被磷酸化。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽包括表5中的至少一种肽。7.一种用于测定磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白与非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的比率的方法，其包括：a.用一种或多种能够使磷酸化RAS-RAF-MAPK靶蛋白发生免疫沉淀的抗体处理生物样品，并且用一种或多种能够使非磷酸化RAS-RAF-MAPK靶蛋白发生免疫沉淀的抗体单独处理所述同一生物样品；b.消化经过免疫沉淀的所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白；c.将已知量的第一和第二可检测标记内部标准肽添加到经过消化的所述蛋白质中，其中所述第一内部标准肽与用于识别所述磷酸化蛋白的磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽具有相同的氨基酸序列，并且所述第二内部标准肽与用于识别所述非磷酸化蛋白的所述非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽具有相同的氨基酸序列；d.通过质谱分析经过消化的所述蛋白质和内部标准品，以测定磷酸化和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽的存在和量，其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽选自SEQIDNO:1到SEQIDNO:1400；以及e.测定所述样品中RAS-RAF-MAPK磷酸化和非磷酸化通路蛋白的数量，并且测定磷酸化靶蛋白与非磷酸化靶蛋白的比率。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品是人。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽是其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽包括表5中的至少一种肽。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于检测非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的所述抗体包括表6中的抗体。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用可检测标记修饰所述肽。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可检测标记包括选自13C、15N、2H和18O的同位素。13.根据权利要求11所述的方法，其中经过修饰的所述肽包括SEQIDNO:701至1400的肽。14.根据权利要求1、2和5到13中任一项所述的方法，其中所述抗体选自表1中所述的抗体。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体能够使多于一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多于一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白选自：a.KRAS、HRAS和NRAS；b.EGFR、SOS1、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、和NRAS、RPS6KA1、PIK3R1、PIK3R2和PIK3CA；c.ERBB2、SOS1、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、和NRAS、RPS6KA1、PIK3R1、PIK3R2和PIK3CA；d.SPRY1、SPRY2、DUSP4、RASA1、NF1、SPRED1、SPRED2、KRAS、HRAS和NRAS；e.将MAPK1/3和TP53一起评估(例如MAPK1/3磷酸化形式pThr202/pTyr204以及TP53磷酸化形式pSer15)；或f.PIK3R1、PIK3R2、PIK3CA、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、NRAS、RPS6KA1、RPS6KB1、AKT1、AKT2、AKT3、MTOR、磷酸化TP53(pSer15)以及磷酸化MAPK1/3(pThr202/pTyr204)。17.根据权利要求16所述的方法，其中所用的所述抗体来自表7中的组合B、C、D、E、F或G。18.根据权利要求1、2和5到17中任一项所述的方法，其中所述方法评估至少一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的非磷酸化形式和磷酸化形式，其包括：g.采用第一抗体和第二抗体，所述第一抗体能够使所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白的磷酸化形式发生免疫沉淀，所述第二抗体能够使通过所述第一抗体沉淀的磷酸化和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀，或h.将所述样品分成两个等分试样，并且使第一等分试样中的总RAS-RAF-MAPK通路蛋白或非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀，并且使第二等分试样中的所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白的磷酸化形式发生免疫沉淀。19.根据权利要求18所述的方法，其中将总TP53和磷酸化TP53一起评估。20.根据权利要求19所述的方法，其中所用的所述抗体来自表7中的组合A。21.根据权利要求1、2和5到20中任一项所述的方法，其中步骤a)包括用能够结合所述通路蛋白的经标记抗体处理所述样品，以提供标记的抗体-蛋白质结合物；以及使所述经标记的抗体-蛋白质结合物与能够结合所述经标记抗体的捕获剂结合，以从所述样品中分离出所述靶蛋白。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记是生物素，并且所述捕获剂是链霉亲和素。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过将已知量的内部标准肽添加到经过消化的所述蛋白质中、随后进行质谱法来测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量，其中所述内部标准肽具有与所述RAS-RAF-MAPK通路肽相同的氨基酸序列并且被可检测地标记，并且通过与所述内部标准品比较而测定RAS-RAF-MAPK通路肽的数量。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括以下的方法测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量：将所述样品中RAS-RAF-MAPK通路肽的量与对照样品中相同RAS-RAF-MAPK通路肽的量进行比较。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括以下的方法测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量：将所述RAS-RAF-MAPK通路肽的量与已知量的内部标准肽进行比较，其中所述生物样品中的肽和所述内部标准肽均选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:701，其中所述标准肽被可检测地标记。26.根据权利要求23和25中任一项所述的方法，其中所述内部标准肽选自SEQIDNO:1至SEQIDNO:700。27.根据权利要求23和25中任一项所述的方法，其中所述内部标准肽选自SEQIDNO:701至SEQIDNO:1400。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述质谱法选自串联质谱法和发现质谱法。29.根据权利要求28所述的方法，其中靶向质谱法选自多反应监测(MRM)、所选反应监测(SRM)和平行反应监测(PRM)或其组合。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自分离的细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织和肿瘤组织。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的相对量。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的绝对量。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化包括蛋白酶或化学消化。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化是单一的或依序的。35.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶消化使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluCbiocarb、LysC/P、LysNpromisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。36.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中化学裂解使用CNBr、亚碘酰苯甲酸盐或甲酸。37.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶消化是胰蛋白酶消化。38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在消化之后且在质谱法之前进行脱盐。39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白选自ALK(UniProtKB-Q9UM73)、ARAF(UniProtKB-P10398)、BRAF(UniProtKB-P15056)、CALM1(UniProtKB-P62158)、CAMK2A(UniProtKB-Q9UQM7)、CCND1(UniProtKB-P24385)、CDH1(UniProtKB-P12830)、CDH2(UniProtKB-P19022)、CDK2(UniProtKB-P24941)、CDKN1A(UniProtKB-P38936)、CDKN1B(UniProtKB-P46527)、CDKN2A(UniProtKB-Q8N726)、CTNNA1(UniProtKB-P35221)、CTNNB1(UniProtKB-P35222)、DDR2(UniProtKB-Q16832)、DUSP22(UniProtKB-Q9NRW4)、DUSP4(UniProtKB-Q13115)、DUSP6(UniProtKB-Q16828)、EGFR(UniProtKB-P00533)、EIF2A(UniProtKB-Q9BY44)、EIF4E(UniProtKB-P06730)、ERFB2(UniProtKB-P04626)、ERBB2(UniProtKB-P21860)、ERBB4(UniProtKB-Q15303)、ESR1(UniProtKB-P03372)、FBXO7(UniProtKB-Q9Y3I1)、FGFR1(UniProtKB-P11362)、FGFR3(UniProtKB-P22607)、FOS(UniProtKB-P01100)、FOXO1(UniProtKB-Q12778)、FOXO3(UniProtKB-O43524)、HRAS(UniProtKB-P01112)、IQGAP1(UniProtKB-P46940)、JAK1(UniProtKB-P23458)、JAK2(UniProtKB-O60674)、KRAS(UniProtKB-P01116)、MAP2K1(UniProtKB-Q02750)、MAP2K2(UniProtKB-P36507)、MAPK1(UniProtKB-P28482)、MAPK11(UniProtKB-Q15759)、MAPK3(UniProtKB-P27361)、MAPK8(UniProtKB-P45983)、MAPK9(UniProtKB-P45984)、MET(UniProtKB-P08581)、NF1(UniProtKB-P21359)、NOTCH1(UniProtKB-P46531)、NRAS(UniProtKB-P01111)、PAK1(UniProtKB-Q13153)、...
【专利技术属性】
技术研发人员：BB帕特尔，J罗杰斯，
申请(专利权)人：皮尔斯生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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