本发明专利技术涉及用于检测样品中的化合物的方法和多肽。特别地，本发明专利技术涉及一种无细胞组合物的用途，所述无细胞组合物包含至少一种包埋在脂双层中的G蛋白偶联受体，当在细胞中表达时，所述G蛋白偶联受体或其亚基的N端在细胞外而C端在细胞内，并且其能够结合所述化合物。任选地，所述组合物还包含至少一种辅助分子，其直接或间接结合所述G蛋白偶联受体的胞内环和/或C端。所述G蛋白偶联受体、和/或当存在时的辅助分子，组合包含生物发光蛋白和接纳体分子，这使得生物发光共振能量转移(BRET)能够用于检测结合所述受体的化合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测样品中的化合物的方法和多肽。特别地，本专利技术涉及一种无细胞组合物的用途，所述无细胞组合物包含至少一种包埋在脂双层中的G蛋白偶联受体， 当在细胞中表达时，所述G蛋白偶联受体或其亚基的N端在细胞外而C端在细胞内，并且其能够结合所述化合物。任选地，所述组合物还包含至少一种辅助分子，其直接或间接结合所述G蛋白偶联受体的胞内环和/或C端。所述G蛋白偶联受体、和/或当存在时的辅助，组合包含生物发光蛋白和接纳体分子，这使得生物发光共振能量转移(BRET)能够用于检测结合所述受体的化合物。
技术介绍
G蛋白偶联受体(GPCR)是跨膜受体家族，其感应细胞外的分子，激活细胞内的信号转导途径并最终激活细胞反应。GPCR仅在包括酵母和动物在内的真核生物中有发现。结合和激活GPCR的配体包括光敏化合物、气味、信息素、激素和神经递质，并且其大小变化从小分子至肽至大蛋白。G蛋白偶联受体涉及许多疾病，并且也是治疗药物的靶标。脊椎动物和秀丽线虫(C. elegans)的气味感受器(OR)是G蛋白偶联受体(GPCR) 家族成员(Buck et al. ,1991 ；Troemel et al.，1995)。GPCR的表征是通过其具有推断在膜的胞外侧上的配体结合结构域和在胞内侧上的G蛋白结合结构域的7个跨膜结构域。当受体结合配体时，受体发生构象变化，允许其激活异源三聚G蛋白(Kobilka et al.，2007)。 然后激活的G蛋白可以激活诸如鸟苷酸环化酶(guanyl cyclase)或磷脂酶C途径的信号转导途径，将信号转导至更高的加工中心(Gaillard et al.，2004)。Forster共振能量转移或简单的共振能量转移(RET)是能量从激发态供体分子至基态接纳体分子的非辐射转移((^hanoimi et al.，2001)。能量转移效率取决于供体和接纳体之间的距离、光谱重叠程度以及接纳体和供体偶极的相对取向。此前分子内RET 被用于监测GPCR激活的实例已使用荧光供体和接纳体，该方法被称为荧光共振能量转移 (FRET)。在大多数情况下，荧光供体和接纳体均为来自维多利亚多管发光水母(Aequoria victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)的工程变体(Tsien，1998)。最广泛使用的FRET对是青色荧光蛋白(CFP)作为供体同时黄色荧光蛋白(YFP)作为接纳体(Piston and Kremers, 2007)，并且该FRET系统先前已被用于定量许多GPCR的直接配体结合(Lohse et al., 2003and 2007 ；Vilardaga et al.，2003 ；Rochais et al.，2007 ；Lisenbee et al. ,2007) 用于监测受体激活的一种方法包括在第三胞内环内和C端的插入位点分别用CFP 和YFP双重标记单个GPCR。用在436nm的光激发CFP引起在480nm的CFP发射并且FRET 至YFP，YFP在535nm发射。FRET效率随着供体和接纳体之间的距离的六次方变化，提供了 GPCR中构象变化的相当(exquisitively)灵敏的指示。这在完整细胞中用α 2AR、甲状旁腺激素受体(ΡΤΗΡ)、β I-AR和促胰液素受体而证实。激动剂去甲肾上腺素(agonists noreadrenaline)与 α 2AR(Lohse et al.，2003)、甲状旁腺激素与 PTHR(Vilardaga et al.，2003)、去甲肾上腺素(nor印in印hrine)与 β l_AR(Rochais et al.，2007)和促胰液素与促胰液素受体(Lisenbee et al. ,2007)的相互作用改变了 CFP和YFP之间的距离，因此引起FRET信号的变化。当用于监测α 2-肾上腺素能受体激活时，在FRET系统(Hoffman et al., 2005 ；Nakanishi et al. ,2006)中用荧光素砷化物发夹结合物(fluorescein arsenical hairpin binder)FlAsH取代YFP接纳体导致激动剂诱导的FRET信号与CFP/YFP系统相比增加了五倍(Nakanishi et al.，2006)。然而，FlAsH涉及较困难的标记和洗涤过程，其在更广泛的研究界具有有限的用途。CFP/YFP系统保留了最常报道的FRET系统用于监测分子内构象变化。与FRET相关的主要缺点是需要光源以便为供体荧光团提供能量(Piston and Kremers，2007)。这引起在供体激发波长的不需要的接纳体直接激发(被称为“串扰 (cross-talk)” 的问题)。在生物发光共振能量转移(BRET)中，用萤光素酶取代FRET的供体荧光团，并且接纳体可以是任何合适的荧光团。使用萤光素酶避免了照射的需要，当加入底物时启动生物发光发射并且因此RET。BRET的两种常见实现方式包含作为供体系统偶联至GFP突变体 YFP (BRET1 ； λ em = 530nm)或 GFP2 (BRET2 ； λ em = 510nm)的海肾(Renilla)萤光素酶 (RLuc)与腔肠素(coelenterazine)h (BRET1 ； λ em = 475nm)或腔肠素 400a(Clz400a)底物(BRET2 ； λ em = 395nm)。在量子产率的消耗下，与BRET1系统的 55nm相比BRET2系统提供了 115nm的供体和接纳体发射峰之间更好的光谱分离(Pfleger and Eidne et al., 2006)。气味感受器的FRET此前仅对于A类( -肾上腺素能和甲状旁腺激素(Vilardaga et al.，2003))和B类(促胰液素(Lisenbee et al.，2007)) GPCR而被证实。与属于A类 GPCR的哺乳动物OR不同，线虫OR (Robertson，1998和2001)不属于这些类，并且在进化和结构上不同。此外，在GPCR超家族的A类之内的包括哺乳动物OR在内的所有0R，对于其表达是非典型的。一般这些蛋白不能被功能性表达，除非在来源于化学感受谱系的神经元中。 已鉴定了许多辅助蛋白，哺乳动物和线虫OR的适当表达需要其存在。因此，需要适当灵敏的方法和分子，使得能够检测结合G蛋白偶联受体的化合物， 用于例如生物传感器。专利技术概述本专利技术人出乎意料地发现利用嵌合的诸如气味感受器(OR)的G蛋白偶联受体 (GPCR)检测靶化合物的无细胞生物发光共振能量转移(BRET)比诸如利用全细胞的BRET或 FRET的其他检测方法更灵敏。因此，在第一方面本专利技术提供了一种检测化合物的方法，所述方法包括，i)用无细胞组合物接触样品，所述无细胞组合物包含a)至少一种G蛋白偶联受体，其包埋在脂双层中，并且能够结合所述化合物，和b)任选存在的至少一种辅助分子，其直接或间接结合所述G蛋白偶联受体的胞内环和/或C端，其中所述G蛋白偶联受体包含相同或不同的一个或多个亚基，并且其中所述G蛋白偶联受体、和/或当存在时的辅助分子，它们组合包含生物发光蛋白和接纳体分子，ii)与步骤i)同时或依次地提供所述生物发光蛋白的底物，并且允许所述生物发光蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·C·特罗韦尔，I·M·霍恩，H·戴克斯，V·利奇，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：
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