一种从血清中早期检测胃癌的方法技术

本发明专利技术提供一种从血清中早期检测胃癌的方法，本发明专利技术是利用由七个质荷比位于４１４１Ｄａ，４４７４Ｄａ，３９４０Ｄａ、４６３３Ｄａ、４７９２Ｄａ、３９５７Ｄａ、４９７６Ｄａ、５３４８Ｄａ、４０９６Ｄａ和５９１５Ｄａ的血清蛋白质组成的指纹图谱来检测，具体通过以下步骤实现：血清准备；质谱数据的收集；对获得的质谱数据采用生物信息学进行分析。本发明专利技术方法为胃癌早期检测提供了新的概念和方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物打下基础；本发明专利技术方法设计合理、可行，结合生物信息学方法和分析方法，具有极高的特异性与敏感性，两者均可达到８４％以上，大大提高了早期胃癌检出率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及恶性肿瘤早期检测方法，为一种新的非侵入性的检测方法，对胃癌进行早期发现、早期检测，其敏感性和特异性均达到84％以上。
技术介绍
胃癌作为全球最常见的第二大恶性肿瘤，仍是癌症死亡的重要原因。在我国胃癌的发病率约为20/10万，死亡率在我国居癌症死亡率的第2位，而就诊患者中多属中晚期，预后差。据统计，根治性手术治疗早期、进展期胃癌的5年生存率分别为90％、40％，所以只有早期发现、早期诊断才能使更多的胃癌患者受益，但早期胃癌多无症状或有非特异性症状，目前我国早期胃癌发现率约10％，故只有对有高危因素的人群进行大规模筛查才能提高早期胃癌的诊断水平。目前检测胃癌最好的方法是纤维胃镜检查，但由于其侵入性操作使大多数人难以耐受而不能用于人群筛查。检测胃癌的非侵入性方法主要有以下几种1.血清肿瘤标志物目前最常用的血清肿瘤标记物主要有CEA、CA199、PG1/2、CA72-4等，在胃癌血清的表达阳性率介于16％-75％之间，难以成为理想的肿瘤标记物而用于临床检测或筛查；2.检测血液中一些常见抑癌基因如P53、APC等的突变、癌基因如c-met、c-erbB2等表达升高也可用于检测胃癌，但均存在敏感性与特异性低的矛盾，用于血清学检测胃癌的作用较小，故寻找一个敏感性与特异性均比较理想的非侵入性且又是高通量快速的检查方法成为目前研究热点，而新兴的蛋白质组学技术及方法的发展则为此提供了技术平台。胃癌的发生、发展大多经历胃炎伴黏膜不典型增生、早期胃癌、进展期胃癌乃至转移的过程，是内外病因交互作用的结果。涉及了多基因及其表达蛋白产物的改变，而蛋白质改变为功能变化的最终形式，蛋白质动态分析更能反映疾病发生和发展。蛋白质组学的主要任务便是识别鉴定机体全部蛋白质，分析其功能及其模式，同时反映恶性肿瘤在疾病发生发展过程中细胞内部的遗传特性和当时环境的影响，以及直接在蛋白水平的表达分析。以往蛋白质组学研究主要依赖双向电泳技术(Two Dimensional Electrophoresis，2DE)，检测的蛋白质数目比估计的细胞内总蛋白少，而一般的2DE能分辨1000～3000个蛋白质点，对细胞内低拷贝蛋白、极端酸性或碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋白(包括膜蛋白)等的电泳分离和检测仍面临很大困难。而蛋白芯片及其分析技术的出现，克服了2DE存在的内在问题，可直接从未预处理样品或微量样本中检测生物标志物--蛋白质质谱，为快速、简便、易行和高通量分析比较提供可能。表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱(Surface-Enhanced LaserDesorption/Inionation-Time Of Flight-Mass Spectra，SELDI-TOF-MS)为近几年发展起来的一种新的蛋白组学研究方法，设计芯片为可结合蛋白的固体点表面，在固体表面涂渍疏水性碳水化合物(Hydrophobic Surface，H4)、亲水表面(Normal Phase，NP)、特异性结合表面(Preactivated Surface，PS)、强阴离子交换表面(Strong Anion Exchange，SAX)、弱阳离子交换表面(WeakCation Exchange，WCX)、固定金属亲和表面(Immobilized Metal AffinityCapture，IMAC)等，可以非特异或特异性结合样品中的蛋白质，结合能量吸收分子(Energy absorb matrix，EAM)后，在真空管中由激光轰击，蛋白质脱离芯片表面，由于其中加有一个正电荷，在电场中向阴极飞去，分子量大的飞行时间长，分子量小的飞行时间短，并依蛋白质的质量和电荷比(M/Z)，每一个蛋白质的峰值明显分离并形成蛋白质(保留在芯片上的蛋白质)的图谱或峰值。SELDI蛋白质芯片技术的优势在于1.可以分析2DE无法分析的蛋白质，包括疏水性蛋白质，等电点(pI)值过高或过低的蛋白质，以及低分子量(＜25kD)的蛋白质；2.可分析未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加了发现疾病标志物的机会；3.被测样品无需使用液相色谱或气相色谱预先纯化，故适用于分析组分复杂的生物样品；4.所需样品量少，检测耗时短，且实验重复性好。这些优势使SELDI蛋白质芯片技术特别适于筛选肿瘤标志物。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种从血清中早期非侵入性检测胃癌的方法，该方法为早期检测胃癌提供了新的途径，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。具体通过以下步骤实现1、血清样本准备(1)取出强阴离子交换表面(SAX)芯片装入生物芯片处理器，每孔加入SAX结合缓冲液预处理芯片；(2)血清样品在冰浴中解冻，取血清与变性缓冲液U9(9M Urea，2％CHARPS，50mM Tris-HCl PH9)充分混匀，再取其中样品与SAX结合缓冲液快速混匀，并将处理好的血清样品加到芯片上； (3)甩去血清样品后每孔加入SAX结合缓冲液，震荡后加入去离子水清洗芯片；(4)取出芯片，待微干后每孔加入0.5ul能量吸收基质SPA，待微干后上机检测，用Ciphergen ProteinChip Software 3.2软件收集质谱信号。2、质谱数据的收集(1)设定激光强度为170，灵敏度为6，收集数据的范围为1000～200000Da分子量蛋白质，收集位置从20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次；(2)收集实验数据前用标准蛋白芯片校正分子量，以质控血清作重复性检测；(3)所有原始数据先用Ciphergen ProteinChip Software 3.2做总离子强度及分子量的均一化；(4)对质荷比位于2000～20000Da的峰值，用软件Biomarker Wizard做噪音过滤，设置初始的噪音过滤值为5，第二次的噪音过滤值为2，以10％为最小阈值进行聚类；(5)得到初步筛选结果，对初步筛选出来的质荷比峰做胃癌组与非胃癌对照组的成组数据平均数比较u检验。3、对获得的质谱数据采用生物信息学进行分析(1)用u检验p值最小的前10个峰作为候选标志物，这10个标志物共有574种组合，评估用这574种组合建立的574个SVM模型；(2)采用留一法交叉检验，每次取出一个样本，用余下样本作为训练集建立SVM诊断模型，用得到的SVM模型来测试取出的一个样本，所有样本均要测试，模型的准确率由测试结果来评估；(3)选出测试的约登指数(约登指数＝敏感性+特异性-1)最高的组合，作为建立模型的最终标志物。(4)所建立的血清蛋白质指纹图谱由七个质荷比(M/Z)位于4141Da、4474Da、3940Da、4633Da、4792Da、3957Da、4976Da、5348Da、4096Da和5915Da的蛋白质(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。附图说明图1为7个组成蛋白质谱的蛋白质峰质荷比分布图；图2为7个质荷比(M/Z)位于3940Da(A)、3957Da(A)、4096Da(A)、4633Da(B)、4792Da(B)、4976Da(C)和5348Da(C)的血清蛋白质的质谱图(左)及相对应的模拟电泳图(右)。(1，2，3为胃癌患者；4，5，6为健康人)；图3为7个M/Z峰的ROC曲线下的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从血清中早期检测胃癌的方法，是通过血清蛋白质指纹图谱来检测，其特征是：该方法通过以下步骤实现：①血清准备；②质谱数据的收集；③对获得的质谱数据采用生物信息学进行分析；所述步骤①采用变性缓冲液为去垢剂，以５ ０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ为强阴离子交换表面结合缓冲液，并采用强阴离子交换表面芯片；所述步骤②是利用表面－增强激光解吸－电离－飞行时间－质谱仪进行质谱数据收集，激光强度为１７０，检测灵敏度为６；　所述步骤③是依据由七个质荷比 位于４１４１Ｄａ、４４７４Ｄａ、３９４０Ｄａ、４６３３Ｄａ、４７９２Ｄａ、３９５７Ｄａ、４９７６Ｄａ、５３４８Ｄａ、４０９６Ｄａ和５９１５Ｄａ的人血清蛋白质组成的质谱模型，并利用生物信息学分析获得检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建，邱福铭，陈益定，郑树，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第二医院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]