本发明专利技术公开了一种血清中PCDH10的TRFIA法检测用试剂盒，包括：PCDH10N-端融合蛋白、能与PCDH10N-端融合蛋白结合的第一抗体和PCDH10C-端融合蛋白、能与PCDH10C-端融合蛋白及镧系金属离子络合物结合的第二抗体，应用于检测血清样品中PCDH10蛋白的时间分辨荧光免疫检测方法。与现有技术相比，本发明专利技术在应用中具有较长荧光寿命，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是镧系金属离子络合物发射的特异荧光。另外其激发光与荧光的波长转变达270nm，可有效排除激发光的干扰，测得的荧光为镧系金属离子络合物发出的特异性荧光信号。所测得的荧光信号强度与待测样品含量成正比。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种血清中P⑶HlO的TRFIA法检测用试剂盒，涉及rcDHIO蛋白C-端和N-端的特异性多肽片段的两种特异抗体的制备，并利用所制备的双抗体，采用时间分辨荧光免疫法(TRFIA)检测血清样品中PCDHlO方法。属于PCDHlO蛋白的抗体制备和时间分辨荧光免疫(TRFIA)分析领域。
技术介绍
P⑶HlO是一个新的肿瘤抑制基因，P⑶HlO蛋白在血清中的显著降低对一些肿瘤 (如大肠癌等)有提示作用。PCDHlO是属于Ca2+依赖性钙粘蛋白家族的一员，具有6个重复串联的胞外区和I个独特的胞内区。浙江大学朱永良等人在对原代肿瘤干细胞基因表达谱时用病毒文库技术筛选时发现pcdhlO+细胞易游出和穿过“Transwell”的半透膜，而 pcdhl0+/+的细胞迁移性较弱。通过生物信息学分析,进一步克隆了 pcdhlO的全长cDNA序列并构建了表达pcdhlO的真核细胞表达载体，通过脂质体瞬时转染k562细胞、SW480大肠癌细胞发现异位表达P⑶HlO抑制了这些细胞在体外的增殖，并增加了细胞的凋亡。进一步发现对这些细进行无血清饥饿和添加化疗药物等处理后PCDHlO表达水平随时间和浓度的增加而增加，提示PCDHlO参与了细胞凋亡，可能是一个肿瘤抑制基因。然对其参与细胞凋亡的分子机制尚不明了。浙江大学朱永良等人的专利技术专利“针对PCDH10C-端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法”(专利号为ZL200810060201)中，利用了 PCR技术从体外培养细胞中克隆了 P⑶HlO蛋白的C-端DNA序列并转化入原核细胞中进行表达，获得了纯化的P⑶HlOC-端多肽,并免疫大白兔,收集并纯化大白兔的抗血清,纯化后获得了 PCDHlO蛋白C-端多肽的抗体。但尚未发现针对PCDHlO蛋白N-端多肽的特异性抗体。所述针对PCDH10C端蛋白片段分子的特异性抗体的制备方法的具体步骤是“1)采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞PCDH10C/pET15b表达载体；2)将PCDH10C/pET15b表达载体转化BL21 DE3pLysS大肠杆菌，建立P⑶HlOC端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化P⑶HlOC端融合蛋白，用Thrombin酶切除P⑶HlOC端融合蛋白N端的His_tag标签，得到P⑶HlOC端融合蛋白；3)用己切除标签的PCDH10C端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、Protein A-Sepharose亲和柱纯化兔抗P03H10C端抗体。”目前市面上尚未有商品试剂盒用于检测该蛋白，所以专利技术一种简单而高灵敏度的方法来测定血清中P⑶HlO蛋白含量以评价患癌症的几率，意义非常重大。时间分辨荧光免疫分析是自上个世纪70年代末80年代初，新发展起来的一项免疫分析方法，它克服了利用荧光素进行荧光免疫分析时背景干扰严重的影响。TRFIA原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，一般采用BHHCT(4，4' -二(I"，1"，1"，2"，2"， 3"，3"-七氟-4"，6"-己二酮-6"-酰基)_氯磺化邻三联苯)，其一端与镧系元素结合，另一端与抗体(蛋白质)分子中的自由氨基结合，制成镧系元素标记的(一般用Eu3+标记)抗体。它与待定抗原结合为免疫复合物。理想情况下，测定复合物中Eu3+的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但是实际上这种复合物种镧系元素的荧光强度非常弱，只有加入一种增强液，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的萘甲酰三氟丙酮(β-ΝΑΤ)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。 用时光分辨荧光仪测定荧光强度cps，即可确定样品抗原中的量。近年来以利用铕络合物为代表的时间分辨荧光免疫检测方法，因其操作方便、环保和高灵敏度的优点正逐渐替代传统的ELISA测定方法，用于临床上。游离的、形成了络合物的铕离子(Eu3+)的放射波为615nm，不会受到激发波长(340nm)或某种蛋白质造成的短寿命背景荧光(350nm 600nm)的影响，所以很适合。BHHCT-Eu3+络合物作为标记化合物， 可与蛋白质直接结合，通过时间分辨型荧光测定可以进行高灵敏度分析。BHHCT具有β -二酮结构，与Eu3+结合的稳定系数高达IOkiM'文献报道，BHHCT-Eu3+络合物已经用于检测人血浆中肿瘤标志物甲胎蛋白和免疫球蛋白E(IgE)的含量。但是，还没有应用上述Eu3+络合物及P⑶HlO双抗体检测血清中P⑶HlO蛋白方法。如上所述，开发一种正确定量、操作简单、稳定而灵敏的检测血清样品中P⑶HlO 蛋白的方法，将对临床诊断和科研研究起到极为重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种血清中P⑶HlO的TRFIA法检测用试剂盒，同时提出 PCDHlO蛋白N-端肽链的制备及其特异性抗体的制备方法，并结合浙江大学PCDHlO蛋白 C-端肽链特异性抗体制备的方法，以利用这两种方法制备出来的抗体为材料，用时间分辨荧光免疫分析方法测定血清中P⑶HlO蛋白的含量。该血清中P⑶HlO的TRFIA法检测用试剂盒简便可行、灵敏度高。本专利技术的一种血清中P⑶HlO的TRFIA法检测用试剂盒，具有能与P⑶HlOC-端融合蛋白结合并被Eu3+络合物标记的第二抗体冻干品；该第二抗体冻干品是经I)以聚合酶链式反应将PCDH10C 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建PCDH10C端融合蛋白的原核细胞表达载体；2)将表达载体转化BL21DE3pLysS大肠杆菌，建立rcDHlOC端融合蛋白的原核细胞表达系统，用His金属螯和树脂纯化P⑶HlOC端融合蛋白，用Thrombin酶切除P⑶HlOC端融合蛋白N端的His-tag标签，得到P⑶HlOC端融合蛋白；3)用己切除标签的P⑶HlOC端融合蛋白作为抗原免疫大白兔，产生抗PCDH10C端抗体，收集抗血清，用硫酸铵沉淀、透析、 Protein A-Sepharose亲和柱纯化所得；还有包被有具有固相结合部分及能与PCDHION-端融合蛋白结合的第一抗体的多孔型微量滴度板。P⑶HlO蛋白检测试剂盒的具体制作方法包括如下步骤(一)P⑶HlON-端片段蛋白质的制备及能与P⑶HlON-端融合蛋白结合的第一抗体的制备。a)采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10N 3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建P⑶HlON-端融合蛋白的原核细胞P⑶H10N/PET32a表达载体。所述的采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将PCDH10N3’端碱基序列克隆至原核细胞，构建P⑶HlON-端融合蛋白的方法是将表达P⑶HlO的IX IO5 IO7人白血病K562细胞离心沉淀，加入O. 5 I. 5ml Trizol充分混匀，提取总RNA，再用逆转录酶转录RNA至cDNA ;然后设计上游引物包含BamH I内切酶位点GGATCC和下游引物包含Hind III内切酶位点AAGCTT，通过PCR的方法直接将P⑶HlON-端DNA序列克隆至pET32aBamH I/ Hind III位点，经BamH I和Hind III内切酶酶切鉴本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵伟，
申请(专利权)人：邵伟，
类型：发明
国别省市：
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