本发明专利技术提供一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法。所述替代性标记选自血清霉菌酸抗原、血清抗霉菌酸抗体或两者。所述方法包括以下步骤：使血清样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合血清样品，所述抗体或其片段基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号；将空白样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合空白样品。该方法包括将两种样品均与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物接触，使得各样品中标记的免疫球蛋白抗体或其片段与所述固定的抗原结合以产生可检测信号。如果存在所述替代性标记，则空白样品产生的信号将比血清样品产生的信号更强，原因是所述标记抗体与血清样品中的霉菌酸抗原优先结合，或所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，或两者，导致血清样品中标记的抗体的结合抑制。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种检测活动性肺结核的方法，尤其但不仅仅涉及一种可用于床旁临床诊断(point of care clinics)的方法。更具体地，本专利技术涉及一种用于哺乳动物个体中结核病或流行结核病的针对脂质抗原或源自结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的脂质抗原的抗体的血清学诊断方法。对于疾病如结核病，至今还没有合意的血清学诊断分析，尽管在针对结核病患者血清中各种结核杆菌抗原的抗体研究方面已经报道了许多进展(Pan等人,1999; Julian等人，2002; Schleicher 等人，2002; Lopez-Marin 等人，2003; Pottunarthy 等人，2000, Steingart等人，2007)。目前南非每10万人中的结核病发病率在全球最高。仅2007年南非有11.2万人死于结核病，其中9. 4万人同时感染有HIV(艾滋病病毒)(WH0，2009)。如果他们能得到及时诊断，死亡人数中的三分之二可得以防止。临床医生面临的最大挑战是准确诊断结核病所用的时间。目前，用常规方法平均花4周时间诊断结核病，这导致了对该疾病治疗的延误。如果能提供快速诊断，患者就可立即接受抗-TB (结核病)治疗，并在几天内成为非感染者。使用当前的诊断方法，带有稳定症状的患者不得不隔离几周以等待结果。这段时间，他们能感染医务人员、接近其的亲属或任何与其共用一个封闭区域如公交车的人。MDR(多重耐药)和XDR(广泛耐药)结核病的产生造成可于两个月内致人死亡的几乎无法医治的疾病在医务人员及其群体传播的危险。人们亟需快速、可靠的结核病诊断工具，尤其是在HIV高发率人群中(Wood等人，2007)。检测与活动性结核病患者血清中抗体有关的病原的免疫诊断分析是一种前景诱人的快速诊断选择。过去一系列分枝杆菌细胞壁组分被认为是针对结核病替代性标记抗体的抗原(Fujiwara 等人，1999; Lyashcenko 等人，1998, Nabeshima 等人，2005)。最近，霉菌酸及其糖脂如脂提取的海藻糖单-或二-霉菌酸、TMM或TDM(索状因子)的抗原活性分别得到评估(Sekanka等人，2007)。在被认为可用于结核病血清诊断的分枝杆菌细胞壁普遍存在的所有抗原中，霉菌酸因其多量、在不同分枝杆菌物种中的变化性和其存在与宿主免疫反应之间联系的特别方式而提供了一个特别的机会(Sekanka等人,2007; Shui等人，2007; Yuan等人，1997)。霉菌酸通过其在树突状细胞的⑶Ib蛋白上存在导致⑶4_、⑶8-双重阴性T细胞的能力(Beckman等人，1994)可能正是相对其他没有感染艾滋病或具有正常CD4T细胞计数的患者，在艾滋病患者中针对霉菌酸的抗体滴度维持甚至很低的CD4T细胞计数的原因(Schleicher等人，2002)。Pan等人已揭示了索状因子抗原的大多数抗原部分为霉菌酸(Pan等人，1999)。尽管准确性有限，使用霉菌酸抗原检测作为替代性标记的抗体用于结核病诊断已表明在酶联免疫分析中是可行的(Pan等人，1999; Schleicher等人,2002)。并发症(complication)之一是在霉菌酸和胆固醇之间人血清抗体的交叉反应性,其导致抗霉菌酸的人结核病阴性血清具有高的抗体结合信号。这很可能是由于胆固醇和霉菌酸的折叠形式之间共有的结构特征，因为胆固醇和霉菌酸均可与两性霉素B( —种胆固醇结合药物)结合(Benadie等人,2008)。所述交叉反应性可能是由于血清中的单特异性抗-胆固醇和抗-MA抗体的混合物，或由于其中特定抗体能特异性识别霉菌酸和胆固醇两者的真正交叉反应性。已知所有人类的血液循环中均含有抗-胆固醇抗体(Swartz等人，1988)，这可以解释结核病阴性病人中针对霉菌酸的高抗体活性。当在竞争性结合分析中使用脂质体中的游离霉菌酸作为抗原时，生物传感器方法显示出其准确性提高至可保证商业化应用的水平(Lemmer等人，2009; Thanyani等人，2008)。该检测后来称为MART1-检测(霉菌酸抗体实时抑制，Mycolic acids Antibody Real-Time Inhibition),通过分析血清样品存在抗霉菌酸抗体作为免疫替代性标记，能够在取样后4小时内诊断活动性结核病，其甚至在HIV感染患者中也很准确。在实时免疫分析中应用抗体的结合抑制似乎很大程度解决了霉菌酸与胆固醇之间交叉反应性的问题。霉菌酸(MA)是高分子量的a-烷基、P _羟基脂肪酸，是分枝杆菌和其他细菌属细胞被膜的特征组分。在分枝杆菌细胞被膜中，MA以游离脂质酯存在，如海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或索状因子和海藻糖单霉菌酸酯(TMM)，但其大部分为酯化的阿拉伯半乳聚糖的末端5-阿糖单元，即一种连接有肽聚糖的多糖(Brennan和Nikaido, 1995)。这种长链脂肪酸的存在是导致分枝杆菌细胞被膜的高疏水性和低渗透性的主要原因(Lee等人，1996)。组成MA的碳原子数目从棒状杆菌属(genus Corynebacterium)中的C2tl-C36至分枝杆菌属(genus Mycobacterium)中的C6tl-C9tl而变化。诺卡氏菌属(Nocardia)和红球菌属(Rhodococcus)细菌MA的长度范围为C36-C66(Butler等人，1991)。分枝杆菌的MA构成了约40-60%的细菌细胞壁干重(Brennan和Nikaido, 1995; Lee等人，1996)。由于霉菌酸对于病原性结核杆菌具有独特的结构，它们为结核病血清诊断提供了理想的抗原。在分枝杆菌属和少数其他属菌种中的霉菌酸包括大量不同结构。在结核杆菌中它们主要由a-、酮基-和甲氧基-MA亚类组成，各自在主要(部分-)(mero-)链的官能团的链长和特定立体化学结构方面有所不同(Dobson等人1985)。是否这些MA中的所有、一些或一个通过结核病患者抗体被检测为抗原并不清楚，这也是当前研究的热点。Pan等人(1999)证明氧化的天然MA，即酮基-和甲氧基-MA，比非氧化的a-MA更具有抗原性，但观察结果还不确定，因为这些MA是作为甲基酯而非自由霉菌酸而被检测的。通过使用特定合成的立体控制的霉菌酸亚类而非使用每批次均会不同的天然MA混合物，能够研发出更灵敏和更准确的诊断分析。由于在分枝杆菌某些生长阶段或疾病某阶段以不同的MA亚类为主，因而特定的合成MA抗原可提供更可靠的数据、揭示该疾病阶段的信息，并更好地区分结核病阳性和结核病阴性患者的血清。自2005年以来，已报道了结核杆菌细胞壁上出现的各种代表性霉菌酸亚类的立体控制的化学合成成果(Al Dulayymi2005，2006和2007, Toschi2006, Koza2007)。现有技术描述专利申请No. PCT/GB95/00856 (Verschoor 和 Bye, 1995)描述了霉菌酸结合至导致在小鼠中产生特定抗体的免疫原性结合物。专利申请NO.PCT/GB96/00416公开了对分枝杆菌霉菌酸的提取和纯化方法的优化(Verschoor, 1996和Goodrum等人,2001)。霉菌酸的免疫学特性在感染结核病的动物和体外培养的人细胞中进行检测，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.15 ZA 2010/050401.一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤 将血清样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合血清样品，所述抗体或其片段基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号； 将空白样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合空白样品；然后 将所述结合血清样品和所述结合空白样品均与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物接触，使得各样品中标记的免疫球蛋白抗体或其片段与所述固定的抗原结合以产生可检测信号，结合空白样品产生的信号比结合血清样品产生的信号更强，原因是所述标记的单克隆抗体与血清样品中的霉菌酸抗原优先结合，或在所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，或两者，导致接触的血清样品中标记的抗体的结合抑制。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清样品和空白样品的结合在横流免疫分析装置的结合垫中进行，结合血清样品和结合空白样品与固定的霉菌酸的接触在横流免疫分析装置的捕获区中进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括在横流免疫分析装置的对照区中将所述结合血清样品和所述结合空白样品的剩余物与固定的抗-免疫球蛋白抗体接触。4.一种使用横流分析装置通过横流免疫分析来检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述装置包括样品垫、结合垫、捕获区、至少两个条带和任选的对照区，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤 将分离的分枝杆菌来源的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物固定于捕获区中， 任选地，将识别所述单克隆抗体或其片段的抗-免疫球蛋白抗体固定于对照区中， 在所述结合垫中将标记的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段提供给霉菌酸，所述抗体基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体或其片段与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号， 将疑似患有结核病的人或动物的血清样品应用于所述横流装置第一条带的样品垫， 将包含缓冲溶液的空白样品应用于所述横流装置第二条带的样品垫， 使所述血清样品和所述空白样品传输至所述结合垫，从而使所述血清样品中的血清霉菌酸抗原、血清抗霉菌酸抗体或两者以及所述空白样品中的缓冲溶液在结合垫中与标记的单克隆免疫球蛋白抗体混合， 使第一条带中含有标记的单克隆免疫球蛋白抗体的血清样品和第二条带中含有标记的单克隆抗体的空白样品传输至捕获区，从而使第一条带中标记的单克隆抗体和血清抗霉菌酸抗体及第二条带中标记的单克隆抗体在捕获区中与固定的霉菌酸结合；与所述空白样品产生的信号相比，通过所述血清样品产生的信号强度的降低来检测标记的抗体与捕获区中霉菌酸抗原的结合抑制，原因是所述标记的单克隆抗体与血清中的血清霉菌酸抗原优先结合，或在所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，导致所述标记的单克隆抗体的结合抑制，以及 任选地，使所述结合血清样品和所述结...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹·阿德里亚努斯·维厄斯库，默文·波克斯，
申请(专利权)人：比勒陀利亚大学，
类型：
国别省市：
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