对杂聚靶核酸序列测序的方法技术

本发明专利技术涉及一种包括随机传感的对杂聚靶核酸序列测序的方法。本发明专利技术还涉及一种通过修饰用于对靶核酸序列测序的孔的一个或多个位点而改良所述孔的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种包括随机传感的。本专利技术还涉及一种通过修饰用于对靶核酸序列测序的孔的一个或多个位点而改良所述孔的方法。
技术介绍
随机检测是一种依赖于对分析物分子和受体之间的各个结合事件的观察结果的传感方法。随机传感器可以通过如下方式形成将纳米尺寸的单孔置于绝缘膜中，并且在存在分析物分子的情况下测量电压驱动的穿过所述孔的离子转运。电流波动的发生频率揭示在所述孔中结合的分析物的浓度。通过其不同的电流特征——特别是电流阻断的持续时间和程度-可揭示分析物的种类(Braha，0.，Walker, B.，Cheley, S.，Kasianowicz, J. J.，Song, L. , Gouaux, J. Ε. , and Bayley, H. (1997) Chem. Biol. 4,497-505 ；禾口 Bayley, H. , and Cremer, P.S. (2001)Nature 413，226-230)。形成细菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已经用于对许多类型的分子进行随机传感(Bayley，H.，and Cremer, P. S. (2001)Nature 413,226-230 ；Shin, S. , H. , Luchian, Τ. , Cheley, S. , Braha, 0. , and Bayley, H. (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41, 3707-3709 ；禾口 Guan，X.，Gu, L. -Q.，Cheley, S.，Braha, 0.，and Bayley, H. (2005) Chem. BioChem. 6，1875-1881)。在这些研究过程中，已发现，试图将α-HL改造以直接结合小的有机分析物被证明是很费力的，且鲜有成功的例子(Guan and colleague，见上文)。幸运的是，已经发现有一种不同的策略，该策略利用了非共价连接的分子衔接体，特别是环糊精(Gu, L. -Q.，Braha, 0.，Conlan, S.，Cheley, S.，and Bayley, H. (1999) Nature 398， 686-690),还有环形肽(Sanchez-Quesada, J. , Ghadiri, Μ. R. , Bayley, H. , and Braha, 0. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122,11758-11766)和葫芦脲(cucurbituril) (Braha, 0.，Webb, J.，Gu, L. -Q.，Kim, K.，and Bayley, H. (2005) Chem. Phys. Chem 6，889-892)。环糊精可短暂地进入所述α-HL孔中，并产生很大程度但不完全的通道阻断。有机分析物在环糊精的疏水内部结合，它们可加强这种阻断，使得分析物可被检测(Gu，L. -Q.，Braha, 0.，Conlan, S.，Cheley, S.，and Bayley, H. (1999)Nature 398,686-690)。现在在大范围应用中需要快速且廉价的DNA或RNA测序技术。现有的技术速度较慢且价格昂贵，主要是因为它们依赖于扩增技术产生大量核酸并且需要大量专门的荧光化学物质进行信号检测。随机传感有可能通过减少所需核苷酸和试剂的量提供快速且廉价的 DNA测序。转移的同聚核酸序列可以被蛋白质纳米孔区分(例如Branton，D.，Deamer，D. W.， Marziali, A. , Bayley, H. , Benner, S. A. , Butler, Τ. , Di Ventra, Μ. , Garaj, S. , Hibbs, Α., Huang, Χ. , et al. (2008)Nature Biotechnology 26,1146-1153)。还可以观察到转移单链 RNA 巾胃 歹白勺$1 (Akeson, Μ. ， Branton, D. ， Kasianowicz, J. J. ， Brandin, Ε.，& Deamer，D. W. (1999)Biophys. J. 77，3227-3233)。在固定 DNA 链末端的各个碱基对也可以在纳米孔内被鉴定(Winters-Hilt，S.，Vercoutere, W.，DeGuzman, V. S.，Deamer,D.，Akeson, M.，& Haussler, D. (2003) Biophys. J. 84，967-976)，但不清楚可以怎样对此修饰使之适合测序。最近，已“在处理过程中(on the fly)”观察到各个修饰的核苷酸碱基 (Mitchell, N. & Howorka，S. (2008)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47，5565-5568)，但这些结构非常巨大。现在不知道使用纳米孔对杂聚核酸序列测序的方法。
技术实现思路
本专利技术人出乎意料地证明了孔可以区分核酸序列中至少四种不同核苷酸。换句话说，本专利技术人出乎意料地证明了孔可以用于通过随机传感对完整的杂聚靶核酸序列测序。本专利技术人还出乎意料地证明，具有两个或多个能够区分不同核苷酸的不同位点的孔显示出改良的核苷酸识别。这类孔可有利地用于对核酸序列测序。如下文更详细描述的， 在孔中存在不止一个能够区分不同核苷酸的位点不仅使得可以确定核酸序列的长度，而且使得可以更有效地确定核酸序列的序列。最后，专利技术人出乎意料地证明，用于对核酸测序的孔可以通过修饰至少一个能够区分不同核苷酸的位点而改良。如果一个孔具有的能够区分不同核苷酸的位点太少，那么可以通过引入一个或多个另外的位点而对其进行改良。如果一个孔具有的能够区分不同核苷酸的位点太多，那么可以通过除去一个或多个所述位点而对其进行改良。孔还可以通过增强或降低一个或多个位点区分不同核苷酸的能力而得到改良。因此，本专利技术提供了一种用于，包括(a)使所述靶序列通过跨膜孔，使得所述靶序列中的一部分核苷酸一次一个地与所述孔中至少一个能够区分不同核苷酸的位点相互作用；并且 (b)测量在每个相互作用过程中通过所述孔的电流，从而确定所述靶序列的序列。本专利技术还提供了 -包含七个包含SEQID NO :4所示序列或其变体的亚基的跨膜蛋白孔用于对靶核酸序列测序的用途；-一种改良用于对靶核酸序列测序的跨膜孔的方法，包括(a)修饰包含一个能够区分不同核苷酸的位点的跨膜孔；并且(b)确定所产生的孔是否包含两个或多个能够区分不同核苷酸的不同位点；-一种改良用于对靶核酸序列测序的跨膜孔的方法，包括(a)修饰包含多于两个能够区分不同核苷酸的不同位点的跨膜孔；并且(b)确定所产生的孔是否包含两个能够区分不同核苷酸的不同位点；-一种改良用于对靶核酸序列测序的跨膜孔的方法，包括(a)修饰包含多于一个能够区分不同核苷酸的不同位点的跨膜孔；并且(b)确定所产生的孔是否包含一个能够区分不同核苷酸的位点；-一种改良用于对靶核酸序列测序的跨膜孔的方法，包括(a)修饰包含两个或多个能够在其中一处区分不同核苷酸的不同位点的跨膜孔； 并且(b)确定其他不同位点中的一个或者多个区分不同核苷酸的能力是本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种对杂聚靶核酸序列测序的方法，包括：（ａ）使所述靶序列通过跨膜孔，使得所述靶序列中的一部分核苷酸一次一个地与所述孔中至少一个能够区分不同核苷酸的位点相互作用；并且（ｂ）测量在每个相互作用过程中通过所述孔的电流，从而确定所述靶序列的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·斯托达特，A·J·郝伦，G·玛格里亚，J·H·P·贝利，
申请(专利权)人：ISIS创新有限公司，
类型：发明
国别省市：GB