本发明专利技术公开了一种提高杂交种种子纯度鉴定效率的方法，它是将3个大小均匀、饱满的种子或其他组织样本进行DNA提取，用于PCR扩增及焦磷酸测序检测SNP/InDel位点的等位基因频率与测试样本中纯度换算数据模型的计算如下：SNP位点等位基因频率换算：Y=-15.427X+111.44，如图1所示；InDel位点等位基因频率换算：Y=-15.141X+109.33，如图2所示；本发明专利技术的方法结合焦磷酸测序技术和SNP/InDel技术进行杂交种种子纯度检测，能够提高鉴定效率3倍，有效降低检测成本，缩短了检测时间，具有很好地市场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业的种子纯度检验
，具体涉及提高基于单核苷酸多态性标记(SNP/InDel )-焦磷酸测序技术检测杂交种纯度鉴定效率的方法，是一种基于DNA池 (DNA pooling)技术的pooling数量确定和数据分型在杂交种种子纯度鉴定上的应用。
技术介绍
种子纯度鉴定的方法有田间试验形态学标记、同工酶标记、RAPD标记、SSR标记等技术，但以上标记技术在操作性、稳定性、多态性等方面不能满足需要。单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP)，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有密度高，遗传稳定性好、易自动化分析等优点，已成为继SSR 标记之后的新一代遗传学标记技术，近年来被广泛应用于作物分子辅助育种及品种鉴定。 Jin-kee Jung 等(2010)利用 Allele Specific PCR (AS-PCR)Wconserved ortholog set II (COSII) markers中筛选出40个辣椒SNP位点，能区分81个商品种子中的79个，能鉴定17个甜辣椒；Wim Deleu等(2009)从甜瓜公共EST数据库发掘SNP标记，鉴定获得45个 SNP位点，丰富了甜瓜基因变异图谱，并将SNP标记用于甜瓜品种鉴定。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是应用于DNA序列分析的新一代技术工具。 在遗传分析中，可以提供核酸序列信息的分子检测技术是“黄金标准”，其权威性比其他DNA 分析方法如Northern杂交，基因芯片和实时定量PCR (Taqman探针)技术更好。其原理是 在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，具有准确性高，重复性好，自动化程度高，操作简单的特点。焦磷酸测序技术平台能够对目标SNP/InDel标记进行分型和等位基因频率进行分析。DNA池技术(DNA pooling)是指把多个样本的DNA按一定比例混合在一起，进行 PCR扩增、基因扫描、基因分型等后续实验分析(Sham et al.，2002)，组成DNA池的样本数量从几个到几千个样本不等。DNA池技术多结合DHPLC、Sanger测序等方法用于SNP位点、 基因频率分析、基因连锁等研究。DNA池技术在不减小检测效力的前提下提高研究效率，缩短研究周期，节省研究经费，目前已广泛应用于医学、动物、植物等基因研究工作中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了一种基于DNA池技术(DNA pooling)的提高杂交种种子纯度鉴定效率的方法。通过数据换算分析，获得种子纯度，提高杂交种纯度鉴定效率3倍。为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案，其特征在于将3个大小均勻、饱满的种子或其他组织样本进行DNA提取，用于PCR扩增及焦磷酸测序检测SNP/InDel位点的等位基因频率分析；其中基因频率与测试样本中纯度换算数据模型的计算方法如下 SNP位点等位基因频率换算=Y = -15. 427X + 111. 44，如图1所示； InDel位点等位基因频率换算Y =-15. 141Χ + 109. 33，如图2所示； 其中Y值为等位基因频率百分数，X值为测试样本中杂交种所占比重。本专利技术所述的方法，其特征在于按如下的步骤进行(1)样本前处理如果为籽粒样本，取3粒大小均勻、饱满的种子，研磨至粉碎，充分混勻，取100-200mg进行DNA提取；如果为叶片组织样本，取3株相同部位叶片，叠加放置，使用适合大小的打孔器打取3个等大小的叶片部分，勻浆混勻，进行DNA提取；(2)SNP/InDel位点等位基因频率测定换算针对作物SNP/InDel位点进行PCR扩增， 扩增所需引物如序列表N01-N08所示；焦磷酸测序检测，在AQ模式下获得该SNP/InDel位点不同基因型的等位基因频率；判断出3株测试样本中的杂交种数量，进而换算成种子纯度。本专利技术所述的方法中PCR扩增引物和焦磷酸测序引物依据该作物SNP/InDel位点使用 PSQ Assay Designsoftware 进行设计。本专利技术通过对供试杂交种进行样品前处理、SNP/InDel位点等位基因频率测定换算，确定杂交种种子纯度。供试杂交种前处理方法为每品种取大小均勻、饱满种子(30株植株，取同一部位叶片)，每3颗种子一起(每3株叶片叠放一起，用打孔器打取等面积叶片)，低温下粉碎/研磨，提取DNA样本。DNA提取方法按市售试剂盒进行。供试杂交种SNP/InDel位点等位基因频率测定换算方法为针对作物SNP/InDel位点，设计PCR扩增引物及焦磷酸测序引物；进行PCR扩增，(扩增所需引物如序列表N01-N08所示)和焦磷酸测序，测序结果通过AQ模式进行分析，获得测试样本的等位基因频率；通过数据换算数据模型计算出3个植株的纯度Y= -15. 427X + 111.44 适于SNP位点等位基因频率换算Y=-15. 141X + 109. 33 适于InDel位点等位基因频率换算其中Y值为等位基因频率百分数，X值为测试样本中杂交种所占比重。为了能更加清楚的说明本专利技术的测定方法，下面对本专利技术的试验方法做以详细的说明。1、原理通过DNA池技术(DNA pooling)将3个样本等量均勻混合，经过DNA提取、PCR扩增及焦磷酸测序检测SNP/InDel位点等位基因频率，等位基因频率与3个样本中来自母本污染种子数量呈线性关系，经数据换算，可得出3个样本中杂交种数量。2、SNP/InDel 位点的选择适合于杂交种纯度鉴定的SNP/InDel位点为父本、母本在该位点分型不同，而Fl代为父本、母本杂交分型的。例如SNP父本为A，母本为T，杂交种Fl代为A/TInDel父本为CC，母本为一(CC缺失)，杂交种Fl代为CC/--本专利技术所述的方法中PCR扩增引物和焦磷酸测序引物依据该作物SNP/InDel位点使用PSQ Assay Designsoftware 进行设计。3、供试样品前处理籽粒供试样品每品种取大小均勻、饱满种子，每3颗种子一起，低温下粉碎/研磨，提取DNA样本。植株供试样品每品种选取长势平均植株，取同一部位叶片，每3株叶片叠放一起，用打孔器打取等面积叶片，低温下粉碎/研磨，提取DNA样本。DNA提取方法按市售试剂盒进行。4、供试杂交种SNP/InDel位点等位基因频率测定换算针对用于作物杂交种纯度鉴定的SNP/InDel位点，设计PCR扩增引物及焦磷酸测序引物；经PCR扩增和焦磷酸测序，测序结果通过AQ模式进行分析，获得测试样本的等位基因频率；通过数据换算数据模型计算出3个植株中杂交种的数量适于SNP位点等位基因频率换算(图1)Y = -15.427X + 111.44 ； 适于InDel位点等位基因频率换算(图2) Y =-15. 141X + 109. 33 ； 其中Y值为等位基因频率百分数，X值为测试样本中杂交种所占比重。本专利技术公开的与现有技术相比本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种提高杂交种种子纯度鉴定效率的方法，其特征在于将３个大小均匀、饱满的种子或其他组织样本进行ＤＮＡ提取，用于ＰＣＲ扩增及焦磷酸测序检测ＳＮＰ／ＩｎＤｅｌ位点的等位基因频率分析；其中基因频率与测试样本中纯度换算数据模型的计算方法如下：ＳＮＰ位点等位基因频率换算：Ｙ ＝ －１５．４２７Ｘ ＋ １１１．４４，如图１所示；ＩｎＤｅｌ位点等位基因频率换算：Ｙ ＝－１５．１４１Ｘ ＋ １０９．３３，如图２所示；其中Ｙ值为等位基因频率百分数，Ｘ值为测试样本中杂交种所占比重。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：兰青阔，王永，赵新，朱珠，郭永泽，程奕，陈锐，于景会，
申请(专利权)人：天津市农业科学院中心实验室，
类型：发明
国别省市：12
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