一种检测作物种子纯度的方法技术

一种检测作物种子纯度的方法，涉及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ微量蛋白电泳结合超敏感银染检测作物种子纯度的方法。本发明专利技术解决了传统的田间种植检测费工费时、检测结果易受环境影响；ＲＡＰＤ技术方法实验技术复杂、实验条件要求高、费用昂贵；同工酶和贮藏蛋白质谱带少，方法复杂、技术难度大、成本高的问题。该方法利用作物种子所含蛋白质种类的不同，采用微量蛋白电泳和超敏感银染技术鉴定种子纯度。该方法包括作物种子处理、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ微量蛋白电泳、超敏感银染、结果分析步骤。本发明专利技术的检测方法与现有方法相比，具有简单易行、灵敏度高、蛋白质谱带多、高效、快速、费用低、便于推广应用的优点。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测作物种子纯度的方法，特别涉及SDS-PAGE微量蛋白电泳，结合超敏感银染检测作物种子纯度的方法。目前蛋白质指纹图谱技术具有分辨率高、多态性强，并且具重演性、高度的个体特异性和环境稳定性，因此能鉴别生物个体之间的微小差异，故能用于种子的真伪和纯度鉴定。蛋白质指纹图谱中的同工酶和贮藏蛋白如谷蛋白、醇溶蛋白，作为生化指标检测作物种子真伪与纯度在我国有很多的报导，但同工酶由于其蛋白质谱带少，多态性少，已不能满足农业上作物种子纯度检测的需要，而贮藏蛋白如醇溶蛋白用于种子纯度鉴定，1986年国际种子检验协会已制定出标准程序，规定应用pH 3.2的PAGE，并建立了小麦、大麦等禾谷类作物种子醇溶蛋白指纹图谱数据库。美国、加拿大、法国已把这一技术运用于种子真伪和纯度检测。但在我国利用该方法检测作物种子纯度还存在困难，原因是该方法复杂、技术难度大、成本昂贵。RAPD技术方法，这是一种分子生物学的方法，即利用随机引物扩增多态性来检测种子纯度及真假。这种方法用于某种作物真假种子的鉴定方面有积极的意义，但用于种子纯度的检测同样存在实验技术复杂、实验条件要求高、费用昂贵等特点，所以在生产上推广受到一定的限制。本专利技术的技术方案是利用作物种子所含蛋白质种类的不同，根据每一种作物都有各自特定的蛋白质指纹图谱的原理，通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异可鉴别作物种子的真伪与纯度。具体方法是采用微量蛋白电泳和超敏感银染技术鉴定种子纯度，该方法包括作物种子处理、SDS-PAGE微量蛋白电泳、超敏感银染、结果分析步骤。作物种子处理是将禾本科作物或蔬菜豆类种子，用10％安替福民消毒10min，蒸馏水彻底冲洗后，在27℃下浸种24h，转入培养皿中，在(24±1)℃下避光培养2-3d，取黄化幼苗子叶、根、胚轴为实验材料。蛋白质样品制备与SDS-PAGE微量蛋白电泳是通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异可见别作物种子的真伪与纯度，具体是取作物种子幼苗鲜嫩组织即实验材料0.1g，剪碎，加1ml0.1 M/L pH7.0磷酸缓冲液，匀浆后置冷冻离心机内5000r/min离心5min，取上清0.2ml，加等体积蛋白变性液，沸水浴中变性3min后冷却，取10ul，进行微量蛋白SDS-PAGE分析。浓度分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为2.5％，首先灌分离胶，待分离胶凝固后，插入塑料梳，然后再灌浓缩胶在120mA条件下电泳7h，凝胶配方如下分离胶配方蒸馏水8.3ml30％丙烯酰胺 10.0ml1.5mol/lTris 0.3ml10％SDS 0.25ml10％AP0.25mlTEMED 0.01ml浓缩胶配方蒸馏水2.54ml30％丙烯酰胺 1.0mlA液 1.25ml10％SDS 0.10mlTEMED 0.005ml10％AP0.10ml 超敏感银染与结果分析是将凝胶置20％三氯乙酸中浸泡过夜，以除去SDS，ddH2O冲洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中摇动4h以上，弃去戊二醛，加ddH2O冲洗3次，每次10min，弃去ddH2O，备染、显色；染液配方NaOH 0.1mmol\L 20ml浓氨水 1.4ml硝酸银 15％4ml把4ml硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动，全部滴完后用无离子水定溶至200ml在洗净的蛋白质凝胶中加染液100ml，摇动染色10-30min。弃去氨银染液，加ddH2O100ml冲洗3-5min，加显色液100ml，不断摇动10-30min至显色条带清晰为止，弃去显色液，加ddH2O100ml冲洗3-5min；显色液配方甲醛40％ 50ul柠檬酸1％0.5ml无离子水定溶至100ml本专利技术的有益效果是克服了现有技术中的不足，本研究中建立的蛋白质指纹图谱技术，采取微量蛋白质电泳和超敏感银染方法，此法可以检出ng级的极微量蛋白，提高了检测方法上敏感性，因此能鉴别生物个体之间的微小差异，具有分辨率高、多态性强，并且具重演性、高度的个体特异性和和环境稳定性，与以往用醇溶蛋白指纹图谱、同工酶指纹图谱检测作物种子纯度相比较，是一种具有简单易行、灵敏度高、蛋白质谱带多、高效、快速、费用低的作物种子纯度的测定方法。在生产上的推广应用是很有价值的。实施例1将黄瓜种子，用10％安替福民消毒10min，蒸馏水彻底冲洗后，在27℃下浸种24h，转入培养皿中，在(24±1)℃下避光培养2-3d，取黄化幼苗胚轴为实验材料。蛋白质样品制备与SDS-PAGE微量蛋白电泳是通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异可鉴别作物种子的真伪与纯度，具体是取作物种子幼苗鲜嫩组织即实验材料0.1g，剪碎，加1ml0.1M/LpH7.0磷酸缓冲液，匀浆后置冷冻离心机内5000r/min离心5min，取上清0.2ml，加等体积蛋白变性液，沸水浴中变性3min后，冷却，取10ul，进行微量蛋白SDS-PAGE分析。分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为2.5％，首先灌分离胶，待分离胶凝固后，插入塑料梳，然后再灌浓缩胶，在120mA条件下电泳7h，凝胶配方如下分离胶配方蒸馏水8.3ml30％丙烯酰胺 10.0ml1.5mol/lTris 0.3ml10％SDS 0.25ml10％AP0.25mlTEMED 0.01ml浓缩胶配方蒸馏水2.54ml30％丙烯酰胺 1.0mlA液 1.25ml10％SDS 0.10mlTEMED 0.005ml10％AP0.10ml超敏感银染与结果分析是将凝胶置20％三氯乙酸中浸泡过夜，以除去SDS，ddH2O冲洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中摇动4h以上，弃去戊二醛，加ddH2O冲洗3次，每次10min，弃去ddH2O，备染、显色；染液配方NaOH 0.1mmol\L20ml浓氨水 1.4ml 硝酸银 15％ 4ml把4ml硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动，全部滴完后用无离子水定溶至200ml在洗净的蛋白质凝胶电泳中加染液100ml，摇动染色10-30min。弃去氨银染液，加ddH2O100ml，冲洗3-5min，加显色液100ml，不断摇动10-30min至显色条带清晰为止，弃去显色液，加ddH2O100ml冲洗3-5min；显色液配方甲醛40％ 50ul柠檬酸1％ 0.5ml无离子水定溶至100ml附图说明图1展示了11粒黄瓜种子的全蛋白SDS-PAGE银染图谱，所检测到的谱型及谱带数完全一致，各谱带的着色性也基本相同， 证明我们所用的黄瓜种子比较纯。实施例3将菜豆种子进行处理，其方法同实施例1，选取菜豆胚根为实验材料。其它同实施例1。图3展示了菜豆胚根的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。菜豆幼苗内蛋白质比较丰富，胚根中含有60多条谱带，个体间在谱带数、谱型、谱带着色性上完全一致，说明种子纯度高。实施例4将小麦种子进行处理，其方法同实施例1。选取小麦叶片为实验材料，其它同实施例1。图4是小麦叶片的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。图4中左面两个泳道是硬粒小麦、右面三个泳道是普通小麦叶片的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。结果检测到的蛋白质谱带，硬粒小麦和普本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测作物种子纯度的方法，其特征在于采用微量蛋白电泳和超敏感银染技术鉴定种子纯度，该方法包括作物种子处理、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ微量蛋白电泳、超敏感银染，结果分析步骤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，程罗根，王振英，彭永康，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]