本发明专利技术公开了一种检测秦川牛AMPD1基因连锁突变的PCR-SSCP方法，该方法是以包含AMPD1基因的待测秦川牛全基因组DNA序列为模板，在2×Reaction?Mix、ddH2O、Forward?primer、Reverse?primer、Golden?DNApolymerase、DNA模板存在的情况下，设计聚合酶链式反应引物，在PCR反应程序下进行扩增，扩增后对PCR产物进行变性，然后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析其片段，从而确定其单核苷酸多态性。该检测方法操作简单、快速、成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及基因单核苷酸多态性(SNPs)的检测，特别涉及一种快速检测秦川牛腺苷一磷酸脱氨酶1 (AMPDl)基因内含子11区域第19416位和第 19421位单核苷酸多态性的PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)方法，该方法利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行检测，并对其进行片段分离，利用凝胶成像系统分析其片段多态性，再结合测序技术，从而准确确定其SNPs。
技术介绍
通过对SNP进行分析，我们可以从遗传学的角度来很好的解释个体表型所造成的差异。SNP和其他分子标记相比较而言，分辨率最高也最为丰富，几乎可以覆盖到整个基因组范围，遗传上相对比较稳定。在动物基因组中SNP分布广泛，每一个核苷酸发生突变的概率大约为10_9，编码区位置可发生突变，5'端、3'端、非编码区以及内含子区域也可以发生突变。虽然SNP的检测方法有很多种，但是各有其自身的特点，而且大多数方法以聚合酶链式反应为主要基础，利用碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行SNP检测和分析。目前，实验室工作人员主要采用以下几种不同的方法来发现SNPs:即直接测序法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNPs检测技术中，直接测序法是最为准确的SNPs检测方法，测序法检测单核苷酸多态性的效率可以达到100%。但是，因为需要用到专门的大型测序仪器，而且需要有熟练操作仪器的技术工作人员，还需要有丰富的测序经验，更为重要的是直接测序的检测费用极其昂贵，对实验人员来说，直接测序无疑不是一种应用于生产实际的理想SNPs检测方法；PCR-RFLP法是利用限制性内切酶可以识别DNA特异位点，并可在特异位点进行识别切割的特点，将其切割成不同大小的片段，从而来判断其多态性。这种检测方法准确，重复性高，但是碱基的替换、插入、缺失可以产生或者消除一个特定的酶切位点，从而改变了用这种酶切割之后产生片段的大小和数目，所以当遇到没有合适的内切酶可以直接切割特异位点时，这种方法就显得无能为力；AS-PCR方法作为一种新型的SNPs检测方法，在未来的应用领域中具有非常的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNPs位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，现有的几种方法均不是一种检测SNPs的理想的遗传标记方法。而基于 PCR的单链构象多态性是以构象为基础的检测基因组中单核苷酸突变的方法。它的基本原理是单链DNA片段呈现复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该技术以其高度的灵敏性(甚至一个碱基的改变也可通过不同的带型检测出来)、操作的简便性(整个实验过程在1 2小时内就能完成)和应用范围的广泛性， 已成为人类和动物遗传育种中快速、灵敏探测已知基因突变位点，识别未知基因突变的一项新技术。AMPD属于多基因家族，其成员有三个，AMPDl是家族成员之一。AMPDl基因存在于所有的真核生物中，但主要是在肌肉中表达，特别是在骨骼肌中高水平的进行表达，并且与肌肉中肌苷酸代谢有关。目前，关于动物AMPDl基因遗传变异的研究国内外主要集中在鼠、 鸡和猪等动物上，未见牛AMPDl基因遗传变异或SWs研究的相关报道。目前中国地方黄牛， 特别是秦川牛AMPDl基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因的功能研究及其遗传变异与生长和胴体性状(如体高、体斜长、腰角宽、空腹24h宰前活重、胴体重、屠宰率等性状)关联的研究仍是空白。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题和缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测秦川牛 AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，该检测方法操作简单、快速、成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现一种检测秦川牛AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，以包含AMPDl基因的待测秦川牛全基因组 DNA 序列为模板,在 2XReaction Mix、ddH20、Forward primer、Reverse primer,Golden DNA polymerase、DNA模板存在的情况下，设计聚合酶链式反应引物，在PCR 反应程序下进行扩增，扩增后将PCR产物放于98°C高温下变性lOmin，从而使DNA双链充分变性为DNA单链。然后再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析，并鉴定其多态片段，得秦川牛AMPDl基因第11内含子区域第19416位和第19421 位分别发生了 T > C和A > G的单核苷酸多态性。所述的聚合酶链式反应引物为上游引物5'-AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ；下游引物5'-GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。所述的PCR 反应程序为95°C预变性 5min，94°C 30s，60°C 40s, 72°C 40s，共 36 个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。所述的PCR反应体系是15 μ L反应体系包括ddH20 6. 1 μ L，2XReaction Mix 7· 5 μ L，上游引物 0· 3 μ L，下游引物 0· 3 μ L，Golden DNA polymerase 0. 2 μ L，含 AMPDl 基因序列的DNA模板0.6 μ L。所述的检测AMPDl基因单核苷酸多态性的方法，聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为 10%。本专利技术根据AMPDl基因的序列设计引物，以秦川牛的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到秦川牛的AMPDl基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较发现在g. 19416T > C和g. 19421A > G两个位置存在SNPs多态性。针对上述的SNPs多态性，本专利技术还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，构建混合DNA样品池，PCR扩增，扩增产物直接测序，特定的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定， 能够简单、快速、低成本、精确的检测其单核苷酸的多态性。本专利技术对秦川牛的SNPs基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNPs位点与秦川牛生长和胴体性状进行关联分析，结果表明该连锁突变位点能够作为秦川牛生长和胴体性状的分子标记。附图说明图1为秦川牛血样基因组DNA电泳检测图。图2为秦川牛AMPDl基因第11内含子PCR产物1. 5%琼脂糖凝胶电泳图。图3为秦川牛AMPDl基因第11内含子PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。下面结合附图说明和专利技术人给出的最佳实施方式对本专利技术做进一步的详细说明， 以使公众对
技术实现思路
从整体上得到充分的理解，而并非对本专利技术保护范围的限定。具体实施例方式以下实施例中所用的主要试剂来源一、常用实验试剂柠檬酸，柠檬酸钠，葡萄糖，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测秦川牛ＡＭＰＤ１基因连锁突变的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法，其特征在于，以包含ＡＭＰＤ１基因的待测秦川牛全基因组ＤＮＡ序列为模板，在２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、ｄｄＨ２Ｏ、Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｏｌｄｅｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤＮＡ模板存在的情况下，设计聚合酶链式反应引物，在ＰＣＲ反应程序下进行扩增，扩增后对ＰＣＲ产物进行变性，然后再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析，并鉴定其多态片段，得秦川牛ＡＭＰＤ１基因第１１内含子区域第１９４１６位和第１９４２１位分别发生了Ｔ＞Ｃ和Ａ＞Ｇ的单核苷酸多态性；所述的聚合酶链式反应引物为：上游引物：５′－ＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡ－３′１８ｂｐ；下游引物：５′－ＧＧＧＣＴＴＡＧＧＧＣＴＣＴＴＧＧＡ－３′１８ｂｐ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小林，贺花，张慧林，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61
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