本发明专利技术提供了检测OTOF基因c.2382_2383delC突变的试剂盒，通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生的原因和类型。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的OTOF突变筛查工作，为感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的诊断和治疗提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及用于检测OTOF基因突变的试剂盒；本专利技术还涉及新的OTOF突变基因及其在诊断和/或治疗感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍的应用。
技术介绍
听神经病/听神经病谱系障碍(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders, ANSD)是由第珊颉神经的听支受损而引起的一种特殊的感音神经性聋。表现为声音可以通过外耳、中耳正常的进入到内耳，但声音信号不能同步地从内耳传输到大脑的听功能异常性疾病。临床听力检查表现为诱发性耳声发射正常、听性脑干反应严重异常的一组听功能障碍症候群。听神经病谱系障碍多自幼年或青春期起病，在高危婴幼儿中发病率约为0. 23%，在各种原因所致的ABR异常的聋病患儿中的发病率高达11%，无性别差异。目前研究表明，听神经病谱系障碍的发病主要和遗传、免疫、感染、中毒、代谢等相关因素相关。按照是否合并其他系统疾病可将遗传性听神经病谱系障碍分为两类一类是合并有其它颅神经和/或周围神经病损的综合征型疾病，如Charot Marie Tooth综合征CMT1型(脱髓鞘型)及CMT2型(轴突型)、费里德赖希共济失调综合征等；另一种是仅有听力下降表现的非综合征型听神经病谱系障碍。非综合征型听神经病谱系障碍由于表型单一，基因型与表型之间有较好的对应关系，逐渐成为近年来的研究热点。Stan■等根据发病部位的不同将其分为TYPE I型(病变部位在听神经)和TYPE II型(病变部位在内毛细胞及突触)。按照遗传模式的不同可将遗传性听神经病谱系障碍分为常染色体显性遗传(AUNAl)、常染色体隐性遗传(NSRAN)和X连锁隐性遗传(AUNXl)以及线粒体DNA突变等。2003年，Varga等运用连锁分析的方法，将四个家系定位在包含OTOF基因所在的2p23区域内，确定OTOF为第一个发现且较为常见的与非综合征型听神经病谱系障碍相关的基因。OTOF基因DNA序列全长101496bp，包含48个外显子，定位于2p23。OTOF基因的编码区，含终止密码子，如SEQ ID NO. I所示。OTOF长亚型变异体的mRNA长度为7172bp，所编码的蛋白质otoferlin (如SEQ ID NO. 2所示)包含1997个氨基酸，可能参与突触囊泡的融合。Otoferlin具有6个I丐离子结合区域(C2domain),其中后4个含有完整的5个天冬氨酸残基，可以与钙离子结合，且存在I个羧基端跨膜区域(TM)，这些结构在脊椎动物都是高度保守的。2006年,Petit教授研究小组观察到小鼠otof基因编码的蛋白质otoferlin在耳蜗内毛细胞与传入神经元所形成的带型突触处呈高表达。敲除otof基因的纯合小鼠表现为极重度耳聋，其内毛细胞带型突触形态保持正常，钙离子流通也正常，但是突触囊泡的胞吐作用却完全废止，因此得出结论otof基因编码的蛋白质otoferlin作为一种钙离子感应器，在内毛细胞带型突触处触发膜融合，从而在内毛细胞突触囊泡的胞吐过程中发挥着重要作用。因此由该基因突变导致的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者病变部位多在耳蜗内毛细胞或突触，人工耳蜗手术治疗效果较好。而国内外对于感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者OTOF基因的筛查发现，携带有该基因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以TypeII型表现为主，适合于人工耳蜗植入。而TYPE I型听神经病谱系障碍患者病变部位在听神经，位置深在，目前尚无有效的治疗方法。因此，利用对感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的OTOF基因的检测进行辅助分型，对于临床治疗具有重要的指导意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供用于检测OTOF突变c. 2382_2383delC(X800)基因的试剂盒，其技术方案为一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于OTOF基因的c. 2382_2383delC(X800)突变的试剂盒，所述试剂盒包括 从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA的PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行测序的试剂；其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含OTOF基因第2382-2383位碱基。具体地，上述PCR引物为选自0T0F-F-1 (SEQ ID NO. 3) :5’ -TGATCAAAACGGAGAAGTCCTAC-3’，0T0F-R-1 (SEQ ID NO. 4) :5’ -AGCTTCTGCAGGAAGTTCTGG-3’ ；0T0F-F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -GGAGGATGAGGCGGAACT-3’，0T0F-R-2 (SEQ ID NO. 6) :5’ -GGGGGTTGTGACACCTTCT-3’ ；0T0F-F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -GCTGTGGCTGCTGGTGAGA-3’，0T0F-R-3 (SEQ ID NO. 8) :5’ -GACAGCTCGGGCCATGAC-3’ ；0T0F-F-4 (SEQ ID NO. 9) :5，-CCAGCATCACCCACACTCCT-3，，0T0F-R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-CGAAGGAGGGGGTGTCAGTG-3，；中的一对。本专利技术的另一个目的是提供上述试剂盒用于检测位于OTOF基因的c. 2382_2383delC突变的方法，包括以下步骤I)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA ；2)以该DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因第2382-2383位碱基；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与OTOF正常基因的序列进行比较，确定是否存在OTOF基因的c. 2382_2383delC突变位点。进一步地,上述方法还包括下述步骤4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 2382_2383delC突变使氨基酸序列自795位发生移码改变，并使氨基酸的编码提前终止于第800位的氨基酸(p. L795S fsx5)。本专利技术的又一个目的在于提供上述试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的用途，将为在感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；同时可以指导临床治疗，并为将来利用这一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。使用本专利技术的试剂盒的检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在OTOF基因c. 2382_2383delC突变，而判断该患者感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生原因及类型。其中，OTOF基因的c. 2382_2383delC碱基改变引起氨基酸编码过程中在795位发生移码改变(p. L795S fsx5),导致编码提前终止于第800位(标记为X800)，形成Otoferlin的截短肽链,丧失其功能,不成熟的表达产物诱导启动体内调节机制,使变异的mRNA降解。OTOF基因突变相关的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍以常染色体隐性遗传的方式传递。专利技术人应用候选基因筛查的方法对17例非综合征型听本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于OTOF基因的c.2382_2383delC(X800)突变的试剂盒，所述试剂盒包括：从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA的PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行测序的试剂；其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因第2382？2383位碱基。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于OTOF基因的c. 2382_2383delC(X800)突变的试剂盒，所述试剂盒包括 从待测样品中提取DNA的试剂； 用于扩增样本DNA的PCR反应试剂； 对PCR扩增产物进行测序的试剂； 其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含OTOF基因第2382-2383位碱基。2.如权利要求I所述的试剂盒，其中所述PCR引物为选自下述引物中的一对 0T0F-F-1:5， -TGATCAAAACGGAGAAGTCCTAC-3，，0T0F-R-1:5’ -AGCTTCTGCAGGAAGTTCTGG-3’ ；0T0F-F-2:5， -GGAGGATGAGGCGGAACT-3，，0T0F-R-2:5’ -GGGGGTTGTGACACCTTCT-3’ ；0T0F-F-3:5， -GCTGTGGCTGCTGGTGAGA-3，,0T0F-R-3:5’ -GACAGCTCGGGCCATGAC-3’ ；0T0F-F-4:5，-...
【专利技术属性】
技术研发人员：王秋菊，
申请(专利权)人：王秋菊，中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：
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