一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用。本发明专利技术设计了扩增根结线虫的通用引物MF、MR和扩增象耳豆根结线虫的特异性引物FMe和RMe，以含有根结线虫的单根结DNA为模板进行PCR扩增反应；将PCR扩增反应产物进行脂糖电泳检测，根据条带有无和大小方面地获得检测结果；所述引物的序列分别如表SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示。本发明专利技术一步双重PCR的检测方法在提高分子检测速度和灵敏度的同时且准确，在象耳豆根结线虫检测方面具有很高的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种象耳豆根结线虫的检测方法与应用。
技术介绍
植物根结线虫(Meloidogyne)是植物根系专性内寄生物，分布遍及世界大部分地区。因其适应性强、传播途径多样、可侵染多种植物，而成为世界性威胁农业生产的主要病原物，给农业生产者造成极大的经济损失。我国根结线虫种类繁多，分布广泛，除常见的南方根结线虫(M. incognita)、爪哇根结线虫(M. javanica)、北方根结线虫(M. hap la) 和花生根结线虫(M.arenaria)4种主要的根结线虫外，近年来调查表明象耳豆根结线虫 (M. enterolobii)在我国南方地区分布较广，并且危害严重。象耳豆根结线虫是1983年报道于我国海南省儋州的一个新种，原始寄主是象耳豆树。近年来研究发现该线虫可以寄生豆科、茄科、葫芦科中的多种经济作物以及番石榴等热带水果，更为重要的是该线虫还可以侵染携带Mi抗性基因的番茄、辣椒、烟草等。2008 年，象耳豆根结线虫首次在欧洲被报道。同年，EPPO报道在中国出口至欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO对该线虫进行风险评估，认为该线虫对中欧地区作物存在较大的风险。值得关注的是，Karssen等在2008年确认玛雅古根结线虫(M. mayaguensis)是象耳豆根结线虫的同种异名。玛雅古根结线虫在非洲、南北美洲及欧洲均有分布，可以寄生的寄主超过8 科20种植物，是国际上公认的危害最大的根结线虫之一。可见象耳豆根结线虫已成为全球热带、亚热带地区作物的一个重要病原物，且可能影响到我国的国际贸易。然而，常规鉴定方法很难对象耳豆根结线虫进行准确鉴定，因为象耳豆根结线虫的会阴花纹同南方根结线虫的会阴花纹非常相似。分子鉴定基本可满足象耳豆根结线虫的检测鉴定，但模板DNA均来自线虫。因此，探索新的灵敏度高的引物、能够直接对单个根结 DNA进行稳定扩增从而实现对象耳豆根结线虫快速检测具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有象耳豆根结线虫快速检测技术的不足，提供一种新的象耳豆根结线虫单根结的检测方法。本专利技术另一个目的是提供所述检测方法的应用。本专利技术的技术问题通过下述技术方案予以实现提供一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法，通过优化的聚合酶链反应检测象耳豆根结线虫，包括以下步骤(1)设计和合成引物；(2)培养根结线虫，提取含有根结线虫的单根结DNA ；(3)以含有根结线虫的单根结DNA为模板进行PCR扩增反应；(4)将PCR扩增反应反应产物进行脂糖电泳检测。步骤(1)所述引物是根据植物线虫大亚基核糖体DNA(基因登录号为AF435803、3AF435794、AY446970、JN005857、FN429017、GQ375158、EU364890、EU570214、AF435793、 AF435802、FJ485651、DQ328713、HQ688681、EU130893 和 EU368591)的 D2D3 设计一对根结线虫通用引物MF和MR;再根据根结线虫mtDNA COII和IrRNA基因(基因登录号为 FJ159631、AY635612、GQ266686、GQ266685、AY446970、GQ870255、AY757882、GQ865513、 HM161680、AY635609、AY757909、AY942848、AY942851 和 EU364883)间区域种间差异设计一对扩增象耳豆根结线虫的特异性引物FMe和RMe。所述引物的核苷酸序列为MF :5，-GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGT-3，；MR :5，-AACCGCTTCGGACTTCCACCAG-3，；FMe :5’ -CATTCATTTATACCAATTTTAGTTGAGG-3’ ；RMe 5，-CAATTATTGAATATTTTTTCCCAAACGA-3，。步骤⑵所述提取含有根结线虫的单根结DNA的步骤如下将单个根结放入加了 45 μ 1 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3 5min,短暂离心后95°C水浴IOmin,然后加入5 μ IlM Tris-HCl (ρΗ值为8. 0)， 混勻，12，OOOg离心30s，直接进行下一步的PCR反应或_20°C保存备用。步骤(3)所述扩增反应是以步骤(2)提取的DNA作为模板，采用双重PCR法进行扩增。所述PCR 反应体系为2XPCR bufferl2. 5μ 1，dNTPs(2mmol/L)5y 1， MF(10 μ mol/L)0. 2 μ 1，MR (10 μ mol/L) 0. 2 μ 1，FMe (10 μ mol/L) 0. 6 μ 1，RMe(10ymol/ L) 0. 6 μ 1，KOD Fx 0. 5U, DNA 模板 4. 0 μ 1 和余量 ddH20，共 25. 0 μ 1。 所述双重PCR扩增反应条件如下94°C预变性2min ；94°C变性30s，64°C退火30s，68°C延伸30s，共40个循环；最后 72°C后延伸5min。步骤(4)所述琼脂糖电泳检测是将5μ 1所述扩增反应产物用琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小可判定鉴定结果。本专利技术提供了所述检测方法的应用，具体是应用于象耳豆根结线虫快速检测方面，可较好地应用于象耳豆根结线虫的田间检测。本专利技术的有益效果是本专利技术提供了一种单个根结DNA的快速制备方法并提供象耳豆根结线虫特异性引物序列和根结线虫通用引物序列，基于所述引物组成双重PCR体系一步法快速特异性检测象耳豆根结线虫。进行所述检测的操作人员无需先分离线虫，线虫核酸的提取时间约 30min，大大缩减检测时间，在提高分子检测灵敏度的同时且快速准确，在象耳豆根结线虫快速检测方面具有很高的实际应用价值。附图说明图1接种象耳豆根结线虫不同时期番茄根结及其内部线虫形态；图2接种象耳豆根结线虫不同时期黄瓜根结及其内部线虫形态；图3接种象耳豆根结线虫不同时期雍菜根结及其内部线虫形态； 图4引物MF/MR和FMe/RMe特异性检测双重PCR结果； 图5接种番茄不同根结线虫后不同时期单根结双重PCR扩增结果；4图6接种黄瓜不同根结线虫后不同时期单根结双重PCR扩增结果；图7接种雍菜不同根结线虫后不同时期单根结双重PCR扩增结果；图8田间病株单根结双重PCR检测结果。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。实施例1(1)单根结DNA的获得播种番茄(夏红一号)、青瓜(新万吉)和蕹菜25天后移苗至直径15cm的装有灭菌土的花盆中，每盆1株。移苗一周后，每株分别接种200条象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的2龄幼虫(J2)，同时保留不接虫的健康植株作为对照，置于光照培养室14h光照，IOh黑暗条件下25°C恒温培养。分别于接种后5d、10d、15d、 20d、25d、30d染色观察线虫形态。同时提取健康根组织DNA和单根结DNA，每个处理取5个重复，设1个空白对照。根部组织染色及不同时期线虫形态观察，步骤如下(1)洗净根组织，放入150ml的烧杯中；(2)加入50ml蒸馏水，并加入适量的5. 25% (体积比浓度)的次氯酸钠(30 50ml)；(3)用玻璃棒不断搅本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（１）设计和合成引物；（２）培养根结线虫，提取含有根结线虫的单根结ＤＮＡ；（３）以含有根结线虫的单根结ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增反应；（４）将ＰＣＲ扩增反应产物进行脂糖电泳检测；其中，步骤（１）所述引物包括扩增根结线虫的通用引物ＭＦ、ＭＲ和扩增象耳豆根结线虫的特异性引物Ｆｍｅ和Ｒｍｅ；所述引物的核苷酸序列分别如表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖金铃，胡茂秀，卓侃，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81