一种寨卡病毒的可视化检测方法技术

本发明专利技术涉及一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括提取寨卡病毒核酸、采用环介导的扩增体系扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段和采用含待测样品的核酸层析试纸条检测的三个步骤。本发明专利技术所述的方法具有特异性好，灵敏度高，快速高效，无污染，能准确、快速检测寨卡病毒的优点，可广泛应用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鉴别诊断、疫情防控、检验检疫等多个领域，尤其是寨卡病毒流行爆发期大样本量的检测。

Visual detection method for stockade card virus

The invention relates to a Zika virus visual detection method, the method includes extracting Zika virus nucleic acid, were amplified with the amplification of Zika virus NS5 gene fragment of RNA loop mediated and three steps including nucleic acid chromatography test sample detection using. The method of the invention has good specificity, high sensitivity, fast and efficient, no pollution, can accurately and quickly detect the advantages of Zika virus, which can be widely used in Zika infection and mixed infection of Zika virus to the early diagnosis, epidemic prevention and control, inspection and quarantine and other fields, especially the detection card village virus epidemic outbreak of large sample.

【技术实现步骤摘要】
一种寨卡病毒的可视化检测方法
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法，特别是涉及寨卡病毒的检测方法。
技术介绍
寨卡病毒属于黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，其主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。1947年首次在乌干达从恒河猴体内被发现寨卡病毒，1952年在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到。2007年以前，世界仅报告14例ZIKV病散发病例，2007年首次在太平洋岛国密克罗尼西亚的雅普岛发现寨卡病毒暴发疫情之后，出现ZIKV感染病例和暴发疫情的国家及地区增加明显，已经在非洲、东南亚和美洲等地造成多次暴发流行。2015年5月，巴西报告首例寨卡病毒感染病例；当年10月份，巴西报告新生儿小头畸形数量处于明显上升，时空分布与寨卡病毒流行区相吻合。截至2016年1月2日，巴西卫生部官方统计数据显示，巴西因寨卡病毒所致的疑似新生儿小头畸形病例已达3174例，其中已有38例死亡，2月初该数字已达4783例。研究表明，除了引起小头畸形以外，寨卡病毒感染还和格林-巴利综合征有也有着密切的联系。疫情的快速蔓延以及与小头畸形之间的可能因果关系，引起了国际社会的广泛关注。寨卡病毒全基因长度约为11Kb，直径40～70nm，有包膜，包含10794个核苷酸，编码3419个氨基酸，寨卡病毒基因编码3个结构蛋白：衣壳蛋白(C)、膜前体蛋白(prM)和包膜蛋白(M)，以及7个非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。目前，国内外对寨卡病毒的诊断方法，主要还是依靠病毒培养、血清学试验、常规的RT-PCR检测及实时荧光定量PCR，其中，血清学试验、组织培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；而RT-PCR也存在容易污染、耗时长的不足，实时荧光PCR技术因为其仪器设备昂贵，不利于一般检测机构的检测及大样本量检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法具有准确、快速和直观的优点。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括以下步骤：(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生产的EasyPureViralDNA/RNAKit的说明书提取寨卡病毒核酸；(2)以步骤(1)得到的寨卡病毒核酸为模板，采用环介导恒温扩增方法(LAMP)扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，获得核酸扩增产物；所述的环介导恒温扩增方法的引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，所述的一对外引物为：Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQNO.1)；Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQNO.2)；所述的一对内侧引物为：Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQNO.3)；Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQNO.4)；所述的一对环引物为：Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQNO.5)；Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQNO.5)；上述环引物Zika-LB5’端标记生物素(Biotin)，环引物Zika-LF5’端标记6-羧基荧光素(6-FAM)；(3)将核酸层析试纸垂直插入所述的核酸扩增产物中，层析5-10min，然后按以下方法判读结果：阳性(+)：核酸层析试纸条的检测区和质控区分别出现一条红色条带；阴性(-)：核酸层析试纸条的质控区出现一条红色条带，而检测区则没有条带；无效：核酸层析试纸条的检测区和质控区均未出现条带；其中，所述的核酸层析试纸条包括条状的塑料支撑片，该塑料支撑片的一表面自一头至另一头依次设有样品垫、聚酯纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述聚酯纤维素膜上喷涂有一层由氯金酸制成的胶体金颗粒上制得的链霉亲和素包被的AuNPs金纳米粒子；所述硝酸纤维素膜上分布有检测区和质控区，其中检测区是在硝酸纤维素膜上喷涂生物素亲和蛋白形成，质控区是在硝酸纤维素膜上喷涂6-羧基荧光素抗体形成。上述方案中，所述的环介导恒温扩增方法的反应体系为：12.5μL2×反应缓冲液(RM)，1μL酶溶液(EM)，浓度为10μM的一对外引物各0.5μL、浓度为10μM的一对内引物各4μL，浓度为10μM的一对环引物各2μL，RNA模板1μL；所述的环介导恒温扩增方法的反应条件为：65℃温育60min，85℃温育5min。本专利技术所述的方法将环介导恒温扩增技术与核酸层析试纸条联合使用，因此具有特异性好，灵敏度高，快速高效，无污染，能准确、快速检测寨卡病毒的优点，可广泛应用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鉴别诊断、疫情防控、检验检疫等多个领域，尤其是寨卡病毒流行爆发期大样本量的检测。附图说明图1是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物在浊度仪引物考察结果示意图。图2是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物引物考察结果可视化示意图。图3是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物在浊度仪温度考察结果示意图。图4是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物温度考察结果可视化示意图。图5是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP检测特异性试验示意图。图6是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP检测特异性试验结果可视化示意图。图7是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP检测灵敏度示意图。图8是本专利技术实施例提供的寨卡病毒LAMP检测灵敏度结果可视化示意图。图9是本专利技术实施例提供的寨卡病毒One-StepRT-PCR特异性和灵敏度电泳图。图10是本专利技术实施例提供的寨卡病毒临床样品血清的检测结果可视化图。图11和12是本专利技术所述核酸层析试纸条的结构示意图，其中图11为主视图，图12为俯视图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合寨卡病毒实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术建立寨卡病毒环介导等温扩增快速检测方法，针对寨卡病毒NS5基因序列设计并合成特异性LAMP引物，优化反应条件，分析其灵敏度和特异性，结果表明所建立的寨卡病毒快速检测检测方法，对登革病毒4种血清型流感病毒H1N1无检出，可检出稀释至10-6(浓度为120fg/μl)的RNA，特异性、灵敏度及稳定性良好。此方法简单、快速，恒温水浴锅65℃反应60min即可完成。反应时，加入的环引物为荧光标记引物，产物进行浊度法检测和横向流核酸层析试纸条检测，比较两者检测结果，验证横向流核酸层析试纸条检测的准确、特异、灵敏性能。下面结合附图及具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步描述。如图1所示，本专利技术实施例的快速检测寨卡病毒的方法包括以下步骤：(1)获取寨卡病毒(武汉大学病毒研究所提供)、4种血清型登革病毒(广东省疾病预防控制中心提供)，将病毒原液接种到长满C6/36细胞的培养瓶中，待细胞病变率达到90％时，收集培养液上清，1500r离心15min，将上清分装，-80℃保存，待用；H1N1流感病毒(广东省疾病预防控制中心提供)，用A549细胞培养。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括以下步骤：(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生产的Easy Pure Viral DNA/RNA Kit的说明书提取寨卡病毒核酸；(2)以步骤(1)得到的寨卡病毒核酸为模板，采用环介导恒温扩增方法扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，获得核酸扩增产物；所述的环介导恒温扩增方法的引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，所述的一对外引物为：Zika‑F3：5’‑TGGGATGTGGTGACTGGA‑3’(SEQ NO.1)；Zika‑B3：5’‑TGCATTGCTACGAACCTTGT‑3’(SEQ NO.2)；所述的一对内侧引物为：Zika‑BIP：5’‑GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG‑3’(SEQ NO.3)；Zika‑FIP：5’‑AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT‑3’(SEQ NO.4)；所述的一对环引物为：Zika‑LF：5’‑TGACCATACGGTGTGGTGT‑3’(SEQ NO.5)；Zika‑LB：5’‑ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG‑3’(SEQ NO.5)；上述环引物Zika‑LB5’端标记生物素(Biotin)，环引物Zika‑LF5’端标记6‑羧基荧光素(6‑FAM)；(3)将核酸层析试纸垂直插入所述的核酸扩增产物中，层析5‑10min，然后按以下方法判读结果：阳性(+)：核酸层析试纸条的检测区和质控区分别出现一条红色条带；阴性(‑)：核酸层析试纸条的质控区出现一条红色条带，而检测区则没有条带；无效：核酸层析试纸条的检测区和质控区均未出现条带；其中，所述的核酸层析试纸条包括条状的塑料支撑片，该塑料支撑片的一表面自一头至另一头依次设有样品垫、聚酯纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述聚酯纤维素膜上喷涂有一层由氯金酸制成的胶体金颗粒上制得的链霉亲和素包被的AuNPs金纳米粒子；所述硝酸纤维素膜上分布有检测区和质控带区，其中检测区是在硝酸纤维素膜上喷涂生物素亲和蛋白形成，质控区是在硝酸纤维素膜上喷涂6‑羧基荧光素抗体形成。...

【技术特征摘要】
1.一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括以下步骤：(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生产的EasyPureViralDNA/RNAKit的说明书提取寨卡病毒核酸；(2)以步骤(1)得到的寨卡病毒核酸为模板，采用环介导恒温扩增方法扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，获得核酸扩增产物；所述的环介导恒温扩增方法的引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，所述的一对外引物为：Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQNO.1)；Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQNO.2)；所述的一对内侧引物为：Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQNO.3)；Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQNO.4)；所述的一对环引物为：Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQNO.5)；Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQNO.5)；上述环引物Zika-LB5’端标记生物素(B...

【专利技术属性】
技术研发人员：李耿，张威，陈思泰，吴建国，赖小平，
申请(专利权)人：广州中医药大学，
类型：发明
国别省市：广东,44