诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，属于生物医药技术领域。该试剂盒包括重组诺如病毒VLPs作为抗原包被的酶标板。本发明专利技术制得的诺如病毒检测试剂盒特异性好，灵敏度高，耗时短，使用成本低且操作简便，对待检样品纯度要求低，特别适用于诺如病毒感染的临床检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒。
技术介绍
诺如病毒(诺瓦克病毒）是人类杯状病毒科（Human Calicivirus，HuCV)中诺如病 毒（Norovirus, NV)属的代表株。诺如病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急 性腹泻患者粪便中分离得到。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病 毒。诺如病毒（Norovirus)是导致急性胃肠炎最主要的病原之一。诺如病毒在全世界范 围内均有流行，全年均可发生感染，但每年10月到次年3月是暴发流行的高发季，老年人和 学龄儿童为易感人群。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，亦可通过污染的水源、食物、 物品、空气等传播，因此常在学校、医院、托儿所、孤老院等人群密集处，尤其是学校引起集 体暴发。感染症状为恶心、呕吐、腹部痉挛性腹泻，儿童患者呕吐为多，成人患者普遍表现为 腹泻，一般在感染病毒后12-48小时出现症状，症状通常持续1-2天。据统计，在我国仅在 2014年2月至2015年7月间，北京、上海、浙江、广东等地区先后暴发超过7起诺如病毒疫 情。 诺如病毒直径约26-35 nm，无包膜；其基因组为单股正链RNA，全长约7. 7 kb，包 含3个开放阅读框。ORFl编码RNA聚合酶等非结构蛋白；0RF2编码主要衣壳蛋白VPl，0RF3 编码次要衣壳蛋白VP2。VPl蛋白结构上可分为S和P区两个相邻的区域，P区可进一步分 为Pl和P2两个亚区，其中S区形成内壳，P区形成拱样结构突出于内壳外P2位于VPl的 最外层，高度变异，目前被认为是免疫识别和受体结合的关键部位。根据VPl序列的同源 性，诺如病毒可分为GI，GII，GIII，GIV，GV五个基因群，其中GI和GII群是引起人类感染 的主要基因群。基因群可进一步分为不同的基因型，其中GII群中的第4基因型GII. 4 - 直是世界范围内最主要的流行株。 目前主要采用real-time RT-PCR检测诺如病毒。real-time RT-PCR法能够准确 检出标本中的诺如病毒，并且可以进一步对病毒进行基因型的研究，但real-time RT-PCR 检测诺如病毒存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此往往需要富集浓 缩病毒，样品浓缩后的病毒回收率和核酸提取的完整程度及纯度会对检测结果影响很大， 且real-time RT-PCR所需的实时荧光定量PCR仪价格昂贵，难以普及。而酶链免疫法特异 性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，检测时仅需一台普通酶标仪，是可广泛推广的检测方 法。因此，本专利技术中的诺如病毒抗体ELISA试剂盒就是为了解决这一问题。
技术实现思路
针对现有诺如病毒检测技术中存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种诺如 病毒抗体EILISA检测试剂盒及其制备方法、应用的技术方案。 所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于包括重组诺如病毒VLPs作 为抗原包被的酶标板。 所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于所述的重组诺如病毒VLPs 通过以下步骤得到： 1) 用引物NoV-IF和NoV-IR对诺如病毒基因组RNA扩增得到诺如病毒0RF2阅读框， 所述的NoV-IF序列如SEQ ID NO. 3所示，所述的NoV-IR序列如SEQ ID NO. 4所示； 2) 用引物N〇V-2F和N〇V-2R对诺如病毒0RF2阅读框扩增得到诺如病毒衣壳蛋白编 码序列，并将该诺如病毒衣壳蛋白编码序列用同源重组的方法连接至PFast Bacl载体获得 pFast Bacl-Nov，所述的NoV-2F序列如SEQ ID NO. 5所示，所述的NoV-2R序列如SEQ ID NO. 6所示； 3) 用pFast Bacl-Nov质粒转化DHlOBac菌株转座获得重组杆状病毒穿梭质粒 rBacmid-Nov ； 4) 用重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，然后用重 组杆状病毒感染Sf9细胞并收获重组诺如病毒VLPs。 所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 用pH=7. 2的PBS缓冲液将重组诺如病毒VLPs稀释至3 μ g/mL，包被96孔聚苯乙 烯酶标板，每孔100 μ L，置4°C冰箱过夜； 2) 用PBST洗液洗涤3次，用封闭液37°C湿盒封闭I h，PBST洗液洗涤3次，干燥后 即为反应板。 所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒在诺如病毒检测中的应用。 利用所述的诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒检测诺如病毒的方法，其特征在于 包括以下步骤： 1) 用pH=7. 2的PBS缓冲液将VLPs稀释至3 μ g/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔 100 yL，置4°C冰箱过夜； 2) 向上述已包被抗原的孔中加入一定稀释的代检样品0.1 mL，置37°C孵育I h，洗涤， 同时做空白，阴性，阳性对照； 3) 于反应孔中加入新鲜的酶标二抗0. lmL，37°C孵育lh，洗涤； 4) 于各反应孔中加入临时配置的TMB底物溶液0.1 mL，37°C孵育10-30 min ; 5) 于各反应孔中加入2 M硫酸0. 05 mL终止反应； 6) 终止反应后30 min内在酶标仪上，以空白对照孔调零后加测各孔450 nm处读数，若 大于规定的阴性对照孔OD值的2倍，即可判定为阳性。 本专利技术的诺如病毒检测试剂盒特异性好，灵敏度高，耗时短，使用成本低且操作简 便，对待检样品纯度要求低，特别适用于诺如病毒感染的临床检测。【附图说明】 图1为PCR扩增0RF2阅读框及T克隆的鉴定。图1中：泳道I :DNA marker DL5000,泳道2 :诺如0RF2基因片段，泳道3 :pCloneEZ空载体，泳道4 :pCloneEZ-Nov〇 图 2 为 pFast Bacl-Nov 载体构建。图 2 中：泳道 I :DNA marker DL10000,泳道 2:引物P2扩增的VPl片段，泳道3:pFast Bacl载体，泳道4:pFast Bacl-Nov。 图3为蓝白斑筛选含重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-Nov的菌株。 图4为凝胶电泳鉴定杆粒。图4中泳道I :DNA marker DL5000,泳道2 :PCR扩增 产物。 图5为重组杆状病毒感染症状。图5中：5 (a):未用重组杆状病毒感染的Sf9细 胞对照，5 (b):重组杆状病毒感染的Sf9细胞。 图6为考马斯亮蓝染色凝胶。图6中：泳道I :Marker,泳道2:未用重组杆状病 毒感染的Sf9细胞上清，泳道2:用重组杆状病毒感染的Sf9细胞上清。 图7为westernblot鉴定重组诺如Nov的表达。图7中：泳道1 :未用重组杆状 病毒感染的Sf9细胞上清，泳道2-5:用重组杆状病毒感染的Sf9细胞上清。【具体实施方式】 以下结合实施例来进一步说明本专利技术。 材料和方法 1.基因，质粒，菌株和细胞 诺如病毒基因组RNA为本室从诺如病毒感染者粪便标本中提取，质粒pClone EZ载体 购自中美泰和公司，DH5a菌株购自日本Takara公司。Sf9细胞，pFast Bacl载体购自本文档来自技高网...
【技术保护点】
诺如病毒抗体EILISA检测试剂盒，其特征在于包括重组诺如病毒VLPs作为抗原包被的酶标板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳玲，张文，申立文，程行健，
申请(专利权)人：杭州庆正鸿科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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