一种过氧化氢全细胞生物传感器及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种过氧化氢全细胞生物传感器及其制备与应用。本发明专利技术首先构建pCM‑lux载体，再构建pCM‑lux‑PahpC质粒，再将构建好的pCM‑lux‑PahpC质粒转入恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中，得到过氧化氢全细胞生物传感器KT2440OX。将KT2440OX菌株的菌液加入待测过氧化氢样品中，读取样品的相对发光强度，利用已知浓度的H2O2样品中加入KT2440OX菌株的菌液后的相对发光强度，建立H2O2浓度与相对发光强度之间的关系，再利用样品的相对发光强度计算样品中的H2O2浓度。与现有技术相比，本发明专利技术可建立科学、准确、快速检测过氧化氢含量的方法，特别适用于直接检测样品中残留的过氧化氢，为国家相关部门制定相应的检测标准，提供一些意见和帮助，是一个非常有前途的过氧化氢残留量的检测方法。

A hydrogen peroxide whole cell biosensor and its preparation and Application

The invention relates to a hydrogen peroxide whole cell biosensor and its preparation and application. The invention first constructs PCM \u2011 lux vector, then constructs PCM \u2011 lux \u2011 pahpc plasmid, and then transfers the constructed PCM \u2011 lux \u2011 pahpc plasmid into Pseudomonas putida KT2440 to obtain hydrogen peroxide whole cell biosensor kt2440ox. Add the bacterial solution of kt2440ox strain to the hydrogen peroxide sample to be tested, read the relative luminous intensity of the sample, use the relative luminous intensity of the known concentration of H2O2 sample after adding the bacterial solution of kt2440ox strain, establish the relationship between the concentration of H2O2 and the relative luminous intensity, and then use the relative luminous intensity of the sample to calculate the concentration of H2O2 in the sample. Compared with the prior art, the invention can establish a scientific, accurate and rapid method for detecting the content of hydrogen peroxide, which is particularly suitable for directly detecting the residual hydrogen peroxide in the sample, providing some opinions and help for the relevant departments of the state to formulate corresponding detection standards, and is an unusual and promising method for detecting the residual hydrogen peroxide.

【技术实现步骤摘要】
一种过氧化氢全细胞生物传感器及其制备与应用
本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种过氧化氢全细胞生物传感器及其制备与应用。
技术介绍
过氧化氢(Hydrogenperoxide)，其水溶液也被称为双氧水，分子式为H2O2，纯品为无色液体，密度1.442g/cm3，熔点-0.41℃，沸点150.2℃。有爆炸性和腐蚀性，同时具有氧化性和还原性，纯品较为稳定，是一种强氧化剂，当含有微量杂质时，光照会催化它的分解，呈弱酸性，有氧化性和还原性(TannerPA,WongAYS.1998.Spectrophotometricdeterminationofhydrogenperoxideinrainwater.AnalyticaChimicaActa370:279-287.)。在人们的日常生活中到处都可以看到过氧化氢的身影，它是一种性能优良的氧化剂、漂白剂、消毒剂和交联剂。过氧化氢是一种非常重要的化工原料，自1990年以来，其应用范围从最初纺织工业逐渐扩大到许多行业，如化工、电子产品、纺织品、食品等(陈迪航,李绵庆.2011.过氧化氢的应用领域与主要生产方法.化工技术与开发40:32-35.)。过氧化氢作为一种十分重要的化工原料，世界各国对其生产研发都十分重视，90年代以后，应用范围从最初的纺织印染逐渐扩大。过氧化氢的高效杀菌、氧化漂白作用和易分解、低残留的特点促使很多食品生产企业超量或非法添加过氧化氢，用来杀灭食品、包装材料及设备容器中的微生物和增加食品的色悦感。过氧化氢由于具有高效杀菌、低残留、易分解、漂白效果好的特点，促使许多食品制造商和工业企业在食品生产、加工、包装材料中使用过氧化氢，用于杀灭生产设备、包装材料和食物中的有害微生物。然而，过量使用过氧化氢和非法添加工业过氧化氢的现象非常严重，从而导致食物中毒事件经常发生。如最近的新闻报道中个别不法商贩用非食品添加剂过氧化氢来加工鸡爪、泡制鲨鱼皮、泡制有毒猪浮皮、漂白开心果、泡蟹肉粒等等类似的食品安全事件。由于过氧化氢本身的性质和其他因素的影响，过氧化氢极不稳定，经食品加工后在食品中的残留量很低，现有的过氧化氢检测方法存在着灵敏度低、准确度差、不适于痕量检测等问题。因此建立一种高效、灵敏、快速检测食品中过氧化氢的检测技术，是食品安全的迫切需要解决的关键技术问题，对过氧化氢的测定方法研究和应用，具有重要的意义(孙佳.2014.食品中过氧化氢的检测方法研究吉林农业大学.)。在国内进行的食品质量检验报告中表明，在部分豆类加工制品、面制品、鱼丸、盐水鸭、盐水鸡等中均有超量的过氧化氢(双氧水)残留；在香港特区的鱼翅中也检测到了高达1.5％的过氧化氢。在中国，食品卫生法规定：食品及保健品中不得有过氧化氢残留。在地域上只允许在内蒙古自治区和哈尔滨地区在生牛乳中可加入6mg/L以下的双氧水为保鲜剂，而国家没有允许在这些地区的牛百叶、牛肚、海蜇、海参、鱼皮、鸭掌、鱿鱼等食品中使用。随着社会的进步和生活水平的提高，关于过氧化氢的残留危害日渐引起人们的注意，国内外很多研究表明，过氢化氢进入人体后副作用极大，它的直接刺激粘膜组织，还会大范围地损害人体细胞，加速人体的衰老、引发癌症等(周健洪,黎晖,宋述财,陈津岩,杜少辉,李伊为,陈东风.2005.过氧化氢对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响.广东医学:1199-1200.)。在环境领域，过氧化氢排放到水体和土壤中后，其浓度较低。在食品工业中，由于过氧化氢通过简单处理后，残留量也一般较低，我国目前现有的过氧化氢残留的测量方法和检测卫生标准已经不能满足人们对食品安全检测的要求。因此食品中过氧化氢的快速、灵敏、定量检测是环保领域和食品安全领域迫切需要解决的关键技术难题。目前分析H2O2的方法大体可分为化学分析方法和仪器分析方法。对于高浓度的样品，一般采用化学滴定分析法，主要有高锰酸钾法、碘量法和硫酸铈法等(王瑞斌.2005.过氧化氢含量准确测定方法的研究.化学工程师:62-64.)。仪器分析方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、流动注射-分光光度法等。仪器分析方法属于痕量分析技术，适于分析低浓度的样品(刘海峰.2009.快速检测食品中过氧化氢残留的生物传感方法的建立上海交通大学.)。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种基于假单胞菌和lux发光基因的过氧化氢全细胞生物传感器及其制备与应用。通过本专利技术，可建立科学、准确、快速检测过氧化氢含量的方法，特别适用于直接检测样品中残留的过氧化氢，为国家相关部门制定相应的检测标准，提供一些意见和帮助，是一个非常有前途的过氧化氢残留量的检测方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术提供一种过氧化氢全细胞生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)构建pCM-lux载体：使用同源重组的方法将lux报告基因连接进入pCMgfp-lacZ质粒，构建pCM-lux载体；其中，pCMgfp-lacZ是已知质粒，在文献ZhangWM,ZhangJJ,JiangX,ChaoHJ,ZhouNY.2015.Transcriptionalactivationofmultipleoperonsinvolvedinpara-nitrophenoldegradationbyPseudomonasspstrainWBC-3.ApplEnvironMicrobiol81:220-230.中曾有报道；扩增lux报告基因所采用的引物为lux基因正向扩增引物：cagaaagcatgccggggatccCTCGAGCTGCAGACTAGTAGGCTTGGAGGATACGTATGAClux基因反向扩增引物：cgtaatcatggtcatggatcTCAACTATCAAACGCTTCGGTTAA其中下划线小写字母序列为载体上的同源臂序列，斜体大写字母为通过引物添加的多克隆位点序列；(2)构建pCM-lux-PahpC质粒：使用同源重组的方法将恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440中ahpC基因的启动子PahpC连接进入pCM-lux质粒，构建pCM-lux-PahpC质粒；其中，恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440为已知的菌株，在文献SongY,HahnT,ThompsonIP,MasonTJ,PrestonGM,LiG,PaniwnykL,HuangWE.2007.Ultrasound-mediatedDNAtransferforbacteria.NucleicAcidsRes35:e129.中有公开，恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440中ahpC基因的启动子PahpC序列已知。扩增启动子时采用的引物为：PahpC启动子的正向扩增引物ahpCinscagaaagcatgccggggatccGAGCCCCTCCTTGAATGTCGPahpC启动子的反向扩增引物ahpCinaagtctgcagctcgagggatccTCATGGGGTTGGAATCAGTTG。(3)将构建好的pCM-lux-PahpC载体测序确认后，利用超声波转化法转入恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440中，含有pCM-lux-PahpC载体的菌株称之为KT2440OX菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过氧化氢全细胞生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pCM‑lux载体：使用同源重组的方法将lux报告基因连接进入pCMgfp‑lacZ质粒，构建pCM‑lux载体；(2)构建pCM‑lux‑PahpC载体：使用同源重组的方法将恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中ahpC基因的启动子PahpC连接进入pCM‑lux质粒，构建pCM‑lux‑PahpC载体；(3)将构建好的pCM‑lux‑PahpC载体测序确认后，转入恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中，所得菌株称之为KT2440OX菌株，即为过氧化氢全细胞生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种过氧化氢全细胞生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pCM-lux载体：使用同源重组的方法将lux报告基因连接进入pCMgfp-lacZ质粒，构建pCM-lux载体；(2)构建pCM-lux-PahpC载体：使用同源重组的方法将恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440中ahpC基因的启动子PahpC连接进入pCM-lux质粒，构建pCM-lux-PahpC载体；(3)将构建好的pCM-lux-PahpC载体测序确认后，转入恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440中，所得菌株称之为KT2440OX菌株，即为过氧化氢全细胞生物传感器。2.根据权利要求1所述一种过氧化氢全细胞生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)扩增lux报告基因所采用的引物为lux基因正向扩增引物：cagaaagcatgccggggatccCTCGAGCTGCAGACTAGTAGGCTTGGAGGATACGTATGAClux基因反向扩增引物：cgtaatcatggtcatggatcTCAACTATCAAACGCTTCGGTTAA其中小写下划线序列为载体上的同源臂序列，斜体大写字母为通过引物添加的多克隆位点序列；步骤(2)扩增启动子时采用的引物为：PahpC启动子的正向扩增引物ahpCinscagaaagcatgccggggatccGAGCCCCTCCTTGAATGTCGPahpC启动子的反向扩增引物ahpCinaagtctgcagctcgagggatccTCATGGGGTTGGAATCAGTTG。3.根据权利要求1所述制备方法获得的过氧化氢全细胞生物传感器。4.如权利要求3所述的过氧化氢全细胞生物传感器的应用，其特征在于，将KT2440OX菌株的菌液加入待测样品中，读取样品的相对发光强度，根据样品的相对发光强度判断样品中是否含有H2O2或计算样品中的H2O...

【专利技术属性】
技术研发人员：高义舟，
申请(专利权)人：上海合森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31