【技术实现步骤摘要】
一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌是烧伤感染的重要病原菌铜绿假单胞菌，是烧、创伤患者局部感染和全身感染的常见病原菌。根据中国细菌耐药检测网2016年调查公布的数据，铜绿假单胞菌在临床中所有的分离病原菌中排5位，占了8.66％。在烧伤病房中，铜绿假单胞菌在所有病原菌中的构成比更高，达到18-43.6％。在很多烧伤病房，尤其是烧伤ICU病房中，铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌交替处于检出率最高的致病菌。铜绿假单胞菌相比鲍曼不动杆菌携带更多的毒力因子。除了荚膜、内毒素外，铜绿假单胞菌还携带III型分泌系统，可以分泌ExoU和ExoS等毒力蛋白。铜绿假单胞菌可引起局部感染，包括皮肤、皮下组织、骨、耳、眼、尿路、心脏瓣膜和术区感染，还可引起全身性感染。铜绿假单胞菌感染不仅会导致烧伤患者创面加深，植皮失败，还可引起烧伤全身感染和脓毒休克，是导致患者死亡的重要病原菌。雪上加霜的是，铜绿假单胞菌的耐药也日益严峻。中国细菌耐药检测网2016年数据指出，在中国分离的铜绿假单...
【技术保护点】
1.一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法，包括以下步骤：1)选择并酶切可诱导的穿梭质粒PHERDB20，通过酶切连接法将dCas9基因插入至PHERDB20穿梭质粒中的阿拉伯糖启动子下游，构建PHERDB20‑dCas9重组质粒；2)依据文献报道铜绿假单胞菌的必需基因和/或非必需基因，基于特德原则，为每条基因选取合适的sgRNA序列，通过吉布森克隆法插入步骤1)的PHERDB20‑dCas9重组质粒中，构建PHERDB20‑dCas9‑sgRNA重组质粒，或者以启动子+20nt靶序列+handle结构+终止子直接合成sgRNA的表达序列，通过酶切‑连接法，构建PHE...
【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法，包括以下步骤：1)选择并酶切可诱导的穿梭质粒PHERDB20，通过酶切连接法将dCas9基因插入至PHERDB20穿梭质粒中的阿拉伯糖启动子下游，构建PHERDB20-dCas9重组质粒；2)依据文献报道铜绿假单胞菌的必需基因和/或非必需基因，基于特德原则，为每条基因选取合适的sgRNA序列，通过吉布森克隆法插入步骤1)的PHERDB20-dCas9重组质粒中，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，或者以启动子+20nt靶序列+handle结构+终止子直接合成sgRNA的表达序列，通过酶切-连接法，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，完成CRISPRi系统的构建；3)选取不同的必需基因，对构建的CRISPRi系统进行验证，任选的4)基于构建的CRISPRi系统筛选潜在的抗生素作用靶点。2.如权利要求1所述的方法，所述sgRNA表达序列，其特征在于:a)所述表达序列的正连上有CCN的序列，b)所述表达序列的序列长度约为20nt，并且靠近ATG区(...
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