一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ‑Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。本发明专利技术能够(1)高效并且快速地敲除铜绿假单胞各种菌株的基因；(2)高效并且快速地在铜绿假单胞各种菌株的基因组上进行基因插入。所述技术在铜绿假单胞菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、铜绿假单胞菌生理研究方面具有广阔地应用前景。

A pCasPA/pACRISPR Dual Plasmid System and Its Application

The invention provides a pCasPA/pACRISPR dual plasmid system, which is characterized by including at least one of pCasPA plasmid and pACRISPR plasmid. The pCasPA plasmid can express Cas9 protein and lambda Red recombination system, and the pACRISPR plasmid can express sgRNA. The invention can (1) efficiently and rapidly knock out the genes of various strains of Pseudomonas aeruginosa; (2) efficiently and rapidly insert genes into the genomes of various strains of Pseudomonas aeruginosa. The technology has broad application prospects in the treatment of Pseudomonas aeruginosa infection, drug target discovery, drug development and physiological research of Pseudomonas aeruginosa.

【技术实现步骤摘要】
一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用
本专利技术涉及一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用。
技术介绍
铜绿假单胞菌是一种常见的革兰氏阴性菌，它广泛存在于环境中，例如泥土、水、植物和人体中，会引起糖尿病、严重创伤、囊肿纤维化、癌症和艾滋病等患者的感染，是一种常见的临床病原菌。绿脓杆菌的感染很难治疗，这很大程度上是由于其低渗透外膜屏障与耐药结节细胞分化(resistance-nodulation-celldivision，RND)家族多药耐药外排泵的协同作用，使得铜绿假单胞菌具有较强的多重耐药性。近年来，铜绿假单胞菌的感染情况日益严重，因此迫切需要寻找新型药物靶标和开发新型药物。基因组编辑和基因筛选技术是研究细菌致病性和抗药性的重要手段，对发现新的药物靶标具有重要意义。目前使用的传统铜绿假单胞菌基因组编辑技术主要基于同源重组双交换的方法。但是该方法操作过程复杂，效率低下，是一件非常费时费力的工作，大大限制了基因的研究工作。近年来最新开发的CRISRP/Cas9系统是一种新型基因组编辑技术，极具革新生命体中基因组修饰与突变技术的潜力。该系统源于细菌自身的免疫系统，用来抵御病毒等外源DNA的侵袭。它主要是由一种核酸内切酶Cas9和一种介导RNA(sgRNA)特异性结合形成复合物，通过sgRNA与基因组DNA碱基互补配对实现靶向识别并精确定位到基因组特定位点。然后Cas9蛋白切割基因组DNA造成双链断裂。结合基因重组酶，通过人为提供外源DNA修复模板进行同源重组修复，就可以快速准确地在基因组的任何位置实现包括基因敲除以及基因插入在内的靶向编辑。CRISPR/Cas9基因组编辑技术已经在哺乳动物细胞以及一些模式生物中，例如斑马鱼、酵母、大肠杆菌等，成功实现了高效的基因组编辑。但到目前为止，还没有在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑的报道。因此通过对CRISPR/Cas9体系的工程化和改造，使其能够应用于铜绿假单胞菌中的基因组编辑，将极大简化铜绿假单胞菌的遗传学操作，为后续基因生物学功能研究，药物靶标发现，新型药物设计以及基因治疗提供有力的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统及其应用。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种。优选地，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ-Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。优选地，所述的pCasPA质粒包含包含λ-Red重组系统基因片段、Cas9蛋白基因片段以及ParaB启动子DNA片段，Cas9蛋白和λ-Red重组系统都受到阿拉伯糖启动子ParaB的调控。优选地，所述的pCasPA质粒包含sacB基因片段。优选地，所述的pACRISPR质粒包含XbaI和XhoI酶切位点，用来插入修复模板。优选地，所述的pACRISPR质粒包含两个BsaI位点，用来插入spacer片段。优选地，所述的pACRISPR质粒包含sacB反向筛选基因片段。优选地，所述的pACRISPR质粒包含sgRNA序列。优选地，所述的pCasPA质粒的序列为SEQIDNO：1。优选地，所述的pACRISPR质粒的序列为SEQIDNO：2。优选地，所述的pCasPA质粒和pACRISPR质粒配合使用，能够在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑，实现基因敲除或基因插入。本专利技术还提供了含有上述的pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种的菌株。本专利技术还提供了含有上述的pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种的细胞。本专利技术还提供了上述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统在基因编辑中的作用。优选地，所述的基因编辑为基因插入或基因敲除。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术能够(1)高效并且快速地敲除铜绿假单胞各种菌株的基因；(2)高效并且快速地在铜绿假单胞各种菌株的基因组上进行基因插入。所述技术在铜绿假单胞菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、铜绿假单胞菌生理研究方面具有广阔地应用前景。本专利技术还提供了含有上述pCasPA质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCCM2018450。本专利技术还提供了含有上述pACRISPR质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCCM2018449。附图说明附图1：编辑质粒pCasPA和pACRISPR图谱；图A.编辑质粒pCasPA图谱。Cas9蛋白和λ-Red重组系统都受到阿拉伯糖启动子ParaB的调控；sacB：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。图B.编辑质粒pACRISPR图谱。BsaI位点：用于GoldenGateAssembly技术插入spacer片段；XbaI和XhoI位点：用于GibsonAssembly技术插入目标基因的修复模板；trcpromoter：sgRNA表达的启动子；sacB：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。附图2：pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因组编辑的过程示意图。附图3：pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌各种菌株中实现高效基因组编辑；图A.pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因敲除的示意图，和在PAO1菌株中进行rhlR基因敲除的PCR验证，色素实验以及DNA测序结果。图B.pCasPA/pACRISPR双质粒系统在铜绿假单胞菌中进行基因插入的示意图，和在PAO1菌株中进行rpsL启动子插入的PCR验证和DNA测序结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本专利技术的一部分实施例，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。各实施例中使用的生物材料来源如下：pKD46质粒(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P0098)；pCasSA质粒(购自美国Addgene公司，货号：98211)；pDN19质粒(购自BioVectorNTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pDN19)；pEX18Ap质粒(购自BioVectorNTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pEX18Ap)；pAK1900质粒(购自BioVectorNTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pAK1900)；铜绿假单胞菌PAO1菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC15692)感受态大肠杆菌DH5α菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P1435)。含有pCasPA质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ‑Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。

【技术特征摘要】
1.一种pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，包含pCasPA质粒和pACRISPR质粒中的至少一种，所述的pCasPA质粒能够表达Cas9蛋白和λ-Red重组系统，所述的pACRISPR质粒能够表达sgRNA。2.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pCasPA质粒包含λ-Red重组系统基因片段、Cas9蛋白基因片段以及ParaB启动子DNA片段，Cas9蛋白和λ-Red重组系统都受到阿拉伯糖启动子ParaB的调控。3.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述的pCasPA质粒包含sacB基因片段，所述的pACRISPR质粒包含sacB反向筛选基因片段。4.如权利要求1所述的pCasPA/pACRISPR双质粒系统，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：季泉江，陈未中，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31