假单胞菌JY-Q果糖代谢基因缺失株的构建方法及应用技术

本发明专利技术分开了假单胞菌JY‑Q果糖代谢基因缺失株的构建方法及应用，以JY‑Q/5Δ为原始菌株，通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因；构建目的基因的敲除载体；利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，以此为供体菌，假单胞菌JY‑Q为受体菌进行双亲本接合；利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；将所得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，发生第二次交换的重组子，即可得到选择性降解的假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株。所述的假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株应用于废烟叶水提液(TWE)尼古丁的降解中。

【技术实现步骤摘要】
假单胞菌JY-Q果糖代谢基因缺失株的构建方法及应用
本专利技术属于环境微生物代谢工程
，通过基因编辑技术将假单胞菌JY-Q(Pseudomonassp.JY-Q)中催化果糖代谢起始步骤的酶基因敲除，获得果糖代谢缺失株，可应用其在尼古丁和果糖共存环境中(如废烟叶水提液,TWE)更高效地降解尼古丁。技术背景尼古丁(Nicotine),又名烟碱，由C、H、N三种元素组成，是一种含氮杂环有机化合物，其分子量为162.23Da，分子式为C10H14N2，化学命名为1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷，是一种众所周知的有毒物质，其对不同的人体和环境都会产生不等的毒副作用，因此需要对尼古丁及其相关污染来源进行治理。目前，通过微生物降解环境中各种有机污染物的事例已经举不胜举，并且表现出良好的降解效果以及绿色低能耗等优势。Pseudomonassp.JY-Q分离自废烟叶水提液(TWE)，并显示出较好的尼古丁降解活性和TWE耐受适应性(详情见专利申请号：201310320679.8，中国典型培养物保藏中心保藏编号:M2013236)。JY-Q/ΔGckΔ12490Δ22860Δ11910Δ058本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.假单胞菌JY‑Q果糖代谢缺失株的构建方法，其特征在于：以JY‑Q/5Δ为原始菌株，包括下述步骤：1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因：PTS1(AA098_22670)和PTS2(AA098_23490)；2)构建目的基因的敲除载体：设计含敲除质粒部分片段的引物，在目的基因上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在目的基因下游同源臂的反向引物5’端加入BamH Ⅰ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3...

【技术特征摘要】
1.假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株的构建方法，其特征在于：以JY-Q/5Δ为原始菌株，包括下述步骤：1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下两个表达果糖磷酸转移酶的同工酶目的基因：PTS1(AA098_22670)和PTS2(AA098_23490)；2)构建目的基因的敲除载体：设计含敲除质粒部分片段的引物，在目的基因上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在目的基因下游同源臂的反向引物5’端加入BamHⅠ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，以此为供体菌，假单胞菌JY-Q为受体菌进行双亲本接合；利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；4)将步骤3)所得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，在反筛选平板上，将发生第二次交换的重组子，即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，从而实现基因无缝敲除；通过以上步骤，可得到选择性降解的假单胞菌JY-Q果糖代谢缺失株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤2)中：PTS1引物为：上游同源臂的上游引物A1：ctatgacatgattacgaattcA...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，章柳泽，王艳颖，何子良，胡祯怡，金维华，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33