本发明专利技术公开了一种阻断人程序性死亡因子1(PD-1)功能的单克隆抗体及其编码基因和应用。它包括重链和轻链，所述的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3的第20位至132位所示，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4的第20位至130位所示。本发明专利技术新发现了一种能阻断人PD-1功能的单克隆抗体43-H-8及其编码基因，该单克隆抗体43-H-8能够与人PD-1抗原特异性结合，半数有效浓度EC50为1.0665nM，可以特异性阻断PD-1/PD-L抑制信号，因此可以将本发明专利技术的单克隆抗体43-H-8作为PD-1通路的阻断剂，从而成为肿瘤免疫治疗、慢性病毒感染性疾病及自身免疫性疾病的治疗一种新药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及抗人PD-1单克隆抗体的制备及可变区序 列及应用。
技术介绍
程序性死亡因子l(programmed cell death 1，PD-1)是在活化T细胞和B细胞表面 上表达的免疫抑制性受体（Yao，Zhu et al.Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)： 130-146)。最初发现时，因其结构类似于⑶28分子，PD-1被认可是⑶28超家族成员。然而H)-1蛋白因缺乏介导CD28/CTLA-4与B7.1/B7.2相结合的MYPPPY序列，以及介导IC0S与IC0S-L 相结合的roPPPF序列，因而在结构上与CD28、CTLA-4及IC0S存在明显差异。因此，PD-1与配 体的结合非常特异，不与其他的B7家族分子产生交叉结合。 PD-1 有两个配体：PD-L1 和 PD-I^JD-Ll 又称 B7H1 或 CD274，PD-L2 称为 B7DC 或 ⑶273JD-1主要表达于⑶4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、B细胞和活化的单核细胞表面，主 要受T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)信号的诱导表达，TNF可增强PD-1在这些细胞表面 的表达（Francisco, Sage et a 1 . , The PD- 1 pathway in tolerance and autoimmunity · Immunol Rev，2010，236:219-242) ePD-Ll和]^-1^2表达于不同的细胞群体 (Shimauchi，Kabashima et al.,Augmented expression of programmed death-1 in both neoplastic and non-neoplastic CD4+T_cells in adult T-ce11 leukemia/ lymphoma · Int J Cancer，2007，121 (12): 2585-2590)，大量的研究表明，PD-L1 与活化的T细 胞上的ro-i相互作用可显著抑制效应性τ细胞的生物学功能，PD-1、ro-Li或ro-L2的表达改 变导致ro-1/PD-L抑制途径发生异常，进而机体发生免疫功能亢进/低下性疾病，PD-1基因 敲除小鼠可引发多种自身免疫性疾病。 研究表明，PD-1信号通路也参与病毒性及微生物感染性疾病的进程。多种慢性和 急性病毒也通过ro-ι和ro-Li信号逃避人体免疫监测。例如:HIV感染者体内PD-1的表达水 平与T细胞的耗竭程度密切相关，且可作为AIDS病情进展的标志之一（Trabattoni， Saresella et al.，B7_Hlis up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease。1'〇8代88；[011.13100(1，2003，101(7):2514-2520)。此现象也 同样适用慢性乙月干患者(Evans ,Riva et al ·，Programmed deathlexpressionduring antiviral treatment of chronic hepatitis B：Impact of hepatitis B-antigen seroconversion ·，Hepatology，2008，48(3): 759-769)。动物实验显不，PD_1基因剔除小鼠 比正常小鼠更好地控制病毒感染;而将HBV特异型T细胞转移到HBV转基因动物中会引发肝 炎。实验证实阻断ro-i信号有可能应用于HIV等病毒感染的临床治疗。 PD-1和PD-L1相互作用以调节控制T细胞的活化在肿瘤和病毒感染中得到了大量 验证。PD-L1表达于多种肿瘤细胞表面，这些肿瘤细胞包括:肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮 肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌，头颈癌。 而且在这些癌症周边也发现了大量表达ro-Ll的⑶8+T细胞。临床统计显示，PD-L1在肿瘤细 胞上的高表达水平与癌症患者不良预后相关(Okazaki和Hon jo 2007，同上）JD-1和PD-L1 之间的相互作用导致渗入肿瘤的淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少、及癌性细胞的 免疫逃避（Dong等人（2003 )J. Mol .Med .81 :281-7 ; Blank等人（20 05) Cancer Immunol · Immunother. 54:307-314 ;Konishi等人（2004)Clin · Cancer Res · 10:5094-100) 〇 研究发现通过抑制ro-i与ro-Li的局部相互作可逆转免疫抑制，而且当ro-i与PD-L2的相互 作用也被阻断时具有累加效果（Iwai等人（2002)Proc.Nat'L·AcacL Sci.USA99:12293-7; Brown等人（2003) J. Immunol. 170 ： 1257-66) 〇 综上所述，通过特异性阻断ro-1 /PD-L抑制信号可以使机体中失能的效应性细胞 恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8+T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋 巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提高机体免疫力，及时清除肿瘤细胞和病 毒。因此，PD-1/ro-L有望成为肿瘤免疫治疗的有效靶分子，也为HIV等慢性病毒感染性疾病 及自身免疫性疾病的治疗提供一个新的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供对hPD-Ι(人PD-1)有很高亲和力的抗体，抗体名称为43-H-8。该抗体能阻断hPD-Ι受体与其配体B7-H1结合，可以应用于治疗抗肿瘤、抗感染及自身免 疫性疾病等治疗药物中。 本专利技术提供1株稳定表达抗体蛋白的杂交瘤细胞株，并保藏在武汉大学中国典型 培养物保藏中心。保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大 学保藏中心。保藏日期为2015年9月28日，保藏编号为CCTCC C2015153。暂无分类命名。 本专利技术提供一种分离的DNA.分子，编码所述抗hPD-Ι人源抗体的重链和或轻链的 可变区或全长氨基酸。抗体重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO: 1的第58位至1407位所示的核苷酸序 列；其抗体轻链可变区的核酸序列为SEQ ID N0:2的第58位至1407位所示的核苷酸序列。 抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:3或其保守型变异序列；其抗体轻链 可变区的氨基酸序列为SEQID N0:4或其保守型变异序列。 SEQ ID NO. 1和2第1位至57位碱基序列是编码信号肽序列的核苷酸序列。 SEQ ID N0.3和4第1位至19位氨基酸序列是信号肽序列。所述抗hPD-1单克隆抗体可以是抗体的全长序列，也可以是抗ro-1抗体的片段，上 述蛋白和抗体包括:重组蛋白，重组抗体、ScFv抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的抗人PD‑1单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)包含选自SEQ ID NO：5氨基酸序列的重链可变区CDR1；b)包含选自SEQ ID NO：7氨基酸序列的重链可变区CDR2；c)包含选自SEQ ID NO：9氨基酸序列的重链可变区CDR3；d)包含选自SEQ ID NO：6氨基酸序列的轻链可变区CDR1；e)包含选自SEQ ID NO：8氨基酸序列的轻链可变区CDR2；f)包含选自SEQ ID NO：10氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏庆，杨晓明，刘云成，杨岚，哈卓，王桂芬，汤炜，
申请(专利权)人：大庆东竺明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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