一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法，将小鼠Krt9基因第434位核苷酸的A突变为GGCT，构建SEQ ID NO:1所示含有重组Krt9基因的打靶质粒载体，筛选携带有重组Krt9基因的小鼠，即为所述人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型；本发明专利技术利用基因打靶技术产生，筛选到了国际上首个Krt9基因敲入突变的小鼠品系，即Krt9-indel小鼠，发现模型小鼠的表型与人EPPK完全一致，从而得到一个从基因到表型完全模仿人EPPK的特异动物模型，可进一步广泛用于人EPPK的致病病因、病理机制等研究，以及对EPPK治疗药物的筛选和基因治疗试验等。

【技术实现步骤摘要】
一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法(一)
本专利技术涉及一种Krt9基因的特异位点c.434delAinsGGCT突变动物模型的构建方法以及动物模型在人表皮松解性掌跖角化症中的应用。(二)
技术介绍
小鼠(Musmusculus)是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因、分子机制、药物以及治疗方法的动物模型。基因打靶胚胎干细胞法是通过同源重组部分替换小鼠打靶基因的DNA序列，所产生的小鼠的表型是这部分DNA序列重要功能的反映。由基因打靶技术获得的动物模型，可用以从整体观察实验动物，推测相应基因的功能，因而这项技术得到了国际公认，专利技术该技术的三位科学家Capecchi、Smithies和Evans获得了2007年的诺贝尔医学奖。迄今，通过基因打靶技术建立的人类疾病小鼠模型已超过500多种。这些模型的建立，极大地丰富了人类对疾病相关基因功能的了解，为疾病机制的研究、新药研发和治疗方案评价提供了重要的宝贵的遗传资源。表皮松解性掌跖角化症(epidermolyticpalmoplantarkeratoderma，EPPK。OMIM：144200)是一种相对常见的致残性常染色体显性遗传性皮肤病，也是最常见的掌跖角化症亚型。EPPK患者出生后数周到数月即有表征，持续终生。临床表现为掌、跖的整个表皮有弥漫性的角质增厚，表面光滑，色黄，在增厚的周边有明显的红斑缘。手掌和脚掌易皲裂，产生疼痛感。症状加剧时，手指活动困难。某些EPPK患者可伴有指节垫、先天性指屈曲和断指等症状。组织病理学检查可见在表皮上基底棘层和颗粒层的角质形成细胞的核周边形成空泡及细胞裂解，电镜观察有角蛋白和张力丝的异常聚集物。Covello等(1988)对北爱尔兰进行的流行病学调查数据显示，EPPK的发病率为4.4/100000。由于本病呈常染色体显性遗传方式，患者生育患病子代的风险高达50％。目前，临床上尚未出现有效的治疗EPPK方法。因此，EPPK严重影响患者的工作、生活质量、婚姻和家庭，带给患者及其家属终身的痛苦。角蛋白9基因(KRT9)是EPPK的主要致病基因，外显率为100％。根据国际人类中间丝数据库(HumanIntermediateFilamentDatabase，www.interfil.org)截止2014年6月的统计数据，在多个种族或民族的EPPK家系或散发病例中已经发现了27种不同的KRT9基因，包括23种错义/无义突变、2种插入突变、1种缺失突变和1种小插缺突变(smallindel)。KRT9基因第1外显子第500位核苷酸的碱基小插缺(indel)突变(c.500delAinsGGCT)，将导致K9分子第167位酪氨酸缺失并插入色氨酸和亮氨酸(p.Tyr167delinsTrpLeu)，为KRT9基因首次报道的插缺突变类型。indel突变是一类相对罕见的基因突变类型。截止2014年4月的统计数据，在HGMD中收录的indel仅占所收录基因突变总数的1.46％。绝大多数的indel与人类疾病相关，它们很少作为DNA多态性存在于健康人群中。因此，indel的生成机制可能更为复杂，其在疾病发生中的意义远大于DNA点突变。带有同源的Krt9基因c.434delAinsGGCT突变的小鼠，其表型与人EPPK十分相似，因而是一种非常好的人EPPK的疾病模型。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用基因打靶技术产生Krt9基因突变的小鼠，从而产生一种人表皮松解性掌跖角化症动物模型的方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种人EPPK小鼠模型的构建方法，所述方法为：(1)将小鼠Krt9基因第434位的A突变为GGCT，构建SEQIDNO:1所示含有重组Krt9基因的打靶载体质粒；(2)将含有重组Krt9基因的打靶载体质粒电转入小鼠胚胎干细胞，得到携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞；(3)将携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的小鼠囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚期细胞移入假孕母鼠(优选2.5d)子宫内待产，移植后(优选第17.5天)获得嵌合鼠；(4)将嵌合率>50％的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，筛选携带有重组Krt9基因的小鼠，即为模拟人表皮松解性掌跖角化症的小鼠模型。进一步，优选所述小鼠为C57BL/6N品系小鼠。进一步，重组Krt9基因质粒载体构建的技术路线为：(1)以Krt9-BAC质粒为模板，在引物PCR1F和PCR1R、PCR2F和PCR2R、PCR3F和PCR3R的作用下进行PCR扩增，分别获得扩增产物Krt9-PCR1、扩增产物Krt9-PCR2和扩增产物Krt9-PCR3；将Krt9-PCR1与载体PL253连接形成质粒Krt9-PCR1-PL253，再将扩增产物Krt9-PCR2与质粒Krt9-PCR1-PL253通过双酶切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PL253，然后将扩增产物Krt9-PCR3与质粒Krt9-PCR1-PCR2-PL253经双酶切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253；(2)将pUC57-krt9CDS载体的第434位的核苷酸A突变为GGCT，形成片段Krt9-5ARM；然后以Krt9-BAC质粒为模板，在引物Krt9-3Arm-F和引物Krt9-3Arm-R的作用下进行PCR扩增，合成扩增产物Krt9-3ARM；将片段Krt9-5ARM和扩增产物Krt9-3ARM与载体PL452连接，形成质粒Krt9-3ARM-5ARM-PL452；(3)将质粒Krt9-3ARM-5ARM-PL452与质粒Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253通过同源重组形成Krt9-突变-loxp-neo-loxp-PL253载体，然后再将Krt9-突变-loxp-neo-loxp-PL253载体进行BstZ17I酶切改造，去除上述步骤(1)三片段PCR扩增产物连接时启动子区引入的BstZ17I酶切位点，获得用于小鼠胚胎干细胞基因打靶的含有重组Krt9基因的终载体，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。进一步，小鼠胚胎干细胞打靶生成模拟人EPPK的小鼠模型的技术路线为：(1)上述所构建的与人EPPK患者携带的KRT9突变c.500delAinsGGCT同源性的小鼠Krt9基因c.434delAinsGGCT突变打靶载体中，包含用于筛选阳性中靶小鼠胚胎干细胞克隆的药筛作用元件loxP-NEO/Kan-loxP片段。用NotI处理质粒，使之线性化，将欲转入小鼠胚胎干细胞的质粒载体的DNA浓度调整约为1μg/μl；(2)将Krt9基因c.434delAinsGGCT突变打靶载体电转入C57BL/6N小鼠胚胎干细胞，挑选同时抗遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的单克隆小鼠胚胎干细胞，并通过PCR反应、SangerDNA测序和Southern杂交，得到携带有Krt9基因c.434delAinsGGCT突变的阳性中靶小鼠胚胎干细胞；(3)将携带有Krt9基因c.434delAinsGGCT突变的阳性中靶C57BL/6N小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的C57BL/6小鼠囊胚期细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法，其特征在于所述方法为：(1)将小鼠Krt9基因第434位核苷酸的A突变为GGCT，构建SEQ ID NO:1所示含有重组Krt9基因的打靶质粒载体；(2)将含有重组Krt9基因的打靶质粒载体电转入小鼠的胚胎干细胞，得到携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞；(3)将携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的小鼠囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚期细胞移入假孕母鼠子宫内待产，移植后获得嵌合鼠；(4)将嵌合率>50％的雄性嵌合体小鼠与野生型雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，筛选携带有重组Krt9基因的小鼠，即为所述人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法，其特征在于所述方法为：(1)①以Krt9-BAC质粒为模板，在引物PCR1F和PCR1R、PCR2F和PCR2R、PCR3F和PCR3R的作用下进行PCR扩增，分别获得扩增产物Krt9-PCR1、扩增产物Krt9-PCR2和扩增产物Krt9-PCR3；将Krt9-PCR1与载体PL253连接形成质粒Krt9-PCR1-PL253，再将扩增产物Krt9-PCR2与质粒Krt9-PCR1-PL253通过双酶切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PL253，然后将扩增产物Krt9-PCR3与质粒Krt9-PCR1-PCR2-PL253经双酶切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253；PCR1F:ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTTTTGTTGGCTAGGATGA；PCR1R:GGACTAGTCCGTATACGTGATGCCCCCATCAGATGGGA；PCR2F:CCGTATACCAGGGTAGGTTCTGGCTTTCTG；PCR2R:GGACTAGTTTGGCGCGCCCCTGAAAGGTGGGTTAGAAAAC；PCR3F:TTGGCGCGCCTATCCTTCCACTCCTCACCTCC；PCR3R:GGACTAGTTCCTCCTCCATAGCTCCCTCC；②将pUC57-krt9CDS载体的第434位的碱基A突变为GGCT，形成片段Krt9-5ARM；然后以Krt9-BAC质粒为模板，在引物Krt9-3Arm-F和引物Krt9-3Arm-R的作用下进行PCR扩增，合成扩增产物Krt9-3ARM；将片段Krt9-5ARM和扩增产物Krt9-3ARM与载体PL452连接，形成质粒Krt9-3ARM-5ARM-PL452；Krt9-3Arm-F:CGGGATCCGTTAACAGGCCTTTCTAGAGTCCAAGCAAAGACAC；Krt9-3Arm-R:ATAAGAATGCGGCCGCTTAATTAAAGGGACCTAACTGTGAACTC；③将质粒Krt9-3A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张咸宁，陈晓玲，吕雅素，高翔，赵静，刘荣荣，姜湖铃，柯海萍，徐晨明，杜振方，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33