单精子多重PCR检测方法技术

本发明专利技术公开一种单精子多重PCR检测方法，包括以下步骤：A、精子预处理，B、显微操作挑取单个精子以及C、单精子多重PCR。本发明专利技术单精子多重PCR检测方法突破了以往对微量细胞的遗传病基因检测只能针对女性卵子和胚胎的局限性，使分析男性生殖细胞是否为嵌合体成为可能。通过本发明专利技术方法可以检测到在体细胞和群体精子中无法检测的、仅在单个精子中存在的极罕见的自发突变；能对父亲生殖细胞新生突变引起的父亲年龄效应系列遗传病进行新生突变的辅助诊断分析，在此基础上联合胚胎植入前遗传学诊断技术，预防阻断该类遗传病患儿出生的风险。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及PCR检测领域，特别是涉及一种单精子多重PCR检测方法。
技术介绍
目前，对于生殖方面的检测主要是集中在女性孕前、产前和新生儿，精子是男性体 内唯一存在的单倍体，对于男性生殖细胞的检测还处于探索阶段。只有对单个精子进行PCR 检测，才是解决生殖细胞自发突变遗传的最好方法。 因为精子是单倍体，DNA量仅是体细胞的一半，只有3pg，并且精子头部染色质的致 密度很高，核蛋白主要是精核蛋白，体积很小，不到卵子的1/20。因此稳定的单精子PCR-直 是一个难题。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种单精子多重PCR检测方法。 为实现专利技术目的，具体技术方案如下： -种单精子多重PCR检测方法，包括以下步骤： A、精子预处理： (A1)将待检测精液液化后分到离心管内，然后加入培养基F-10; (A2)均匀吹打，混匀，离心； (A3)弃上清液，再在所述离心管中加入培养基F-10,与精子沉淀物充分混匀后离 心； (A4)弃上清液，将所述离心管底部的精子沉淀物轻柔地打散，然后在所述离心管 中加入含血清的培养基F-10; (A5)将所述离心管孵育4δ~6〇min; (A6)取出所述离心管，吸取上清液中云雾状明显的部分（上清液的中上层呈云雾 状，即为含较高活力精子的液体），得预处理后的精子； B、显微操作挑取单个精子： (B1)在无菌培养皿内制备聚维酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)溶液滴，然后用 矿物油覆盖； (B2)制作显微针：制作长度为4.5cm~5.5cm的无菌毛细玻璃管，排出所述无菌毛 细玻璃管中的气体，得显微针，所述显微针内径为5~Sum，两端平整； (B3)调节倒置显微镜，安装所述显微针至所述倒置显微镜上，通过显微操作仪将 所述步骤A预处理后的精子移至所述聚维酮溶液滴中，每个所述聚维酮溶液滴移有一个所 述步骤A预处理后的精子； (B4)将另一所述显微针套在口吸管上，在体视显微镜下，分别将所述步骤(B3)后 含有单个精子的所述聚维酮液滴转移至PCR管中； C、单精子多重PCR: (Cl)在每个所述PCR管中加入裂解液裂解，温育； (C2)选择引物进行多重PCR扩增。 上述步骤A的原理为利用活动精子的游动能力，即能游过液体界面进入不同的培 养液，从而与死精子、活动能力差的精子、凝集精子、畸形精子、红、白细胞及其他有害成分 及杂质自行分离;对于精液异常者，则步骤(A5)孵育时间为60min。 上述步骤B1中所使用的聚维酮(PVP)可以减缓精子的前进速度，便于制动精子。 在其中一些实施例中，所述步骤(C1)中的裂解液含有0.09~0.11M的DTT(二硫苏 糖醇）和〇.38~0.42M的Κ0Η。 在其中一些实施例中，所述步骤(C1)中的温育为在64~66°C温育9~llmin。 在其中一些实施例中，所述步骤(C2)所采用的引物如SEQIDN0:1~SEQIDN0:2 以及SEQIDNO:3~SEQIDNO:4所示。 在其中一些实施例中，所述步骤(C2)中50ul的PCR反应体系为:5ul裂解液，5ul中 和液，5ul10Xbuffer，2ul25mMMgCl2,4ul5mMdNTP，lul10uM引物/每对，0.2ulDNA Polymerase，双蒸水至 50ul。 在其中一些实施例中，所述步骤(C2)中的扩增条件为:95°C15min，95°C4min; 96°C 35sec，56°C35sec，72°C35sec，lOcycles;94°C20sec，51°C25sec，72°C25sec，40cycles; 72 °C5min〇 在其中一些实施例中，所述步骤(A2)为均匀吹打，混匀，以1200r/min离心9~ llmin;所述步骤(A3)中的离心为在1200r/min离心9~llmin。 在其中一些实施例中，所述步骤(A5)为将所述离心管倾斜45°角，置于36~38°C， 5 %C02培养箱内孵育45~60min。 在其中一些实施例中，所述步骤(B2)中显微针的制备方法为:在10cm的无菌毛细 玻璃管的其中一面的4.5cm和5.5cm处分别做标记;将拉针器的加热装置固定在两个标记之 间，调整所述拉针器的各参数;拉针成功后取下一段所述无菌毛细玻璃管，套上注射器;置 于超纯水中，推动注射器，见到气泡出来;再次推注射器，确认气泡出来；启动磨针器，在锻 针器的显微镜上观察，将所述无菌毛细玻璃管断端打磨平整，得显微针，所述显微针内径为 5 ~8um〇本专利技术相较现有技术的优点以及有益效果为： (1)本专利技术单精子多重PCR检测方法突破了以往对微量细胞的遗传病基因检测只 能针对女性卵子和胚胎的局限性，使分析男性生殖细胞是否为嵌合体成为可能;通过本发 明方法可以检测到在体细胞和群体精子中无法检测的、仅在单个精子中存在的极罕见的自 发突变；能对父亲生殖细胞新生突变引起的父亲年龄效应系列遗传病（Paternalage efTeCt，PAE)进行新生突变的辅助诊断分析，在此基础上联合胚胎植入前遗传学诊断技术 (preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)，预防阻断该类遗传病患儿出生的风险。 (2)本专利技术单精子多重PCR检测方法可以同时检测一个精子的多个基因突变位点， 效率更高，临床应用更广;本专利技术技术平台为国内首次建立，在国际上也是首次应用于男性 生殖细胞嵌合体的分析和遗传病单、多基因的突变检测和分析。 (3)本专利技术应用广泛，可应用于遗传病的家系分析、基因突变检测、DNA测序和产前 诊断等领域。【附图说明】图1为实施例1中PKHD1基因c.2347位点的测序峰图；图2为实施例1中PKHD1基因c. 4874位点的测序峰图。【具体实施方式】 以下通过具体实施例进一步阐述本专利技术。 本专利技术以下实施例所用原料、设备均为市售普通原料。 实施例1 -种单精子多重PCR检测方法，包括以下步骤：A、精子预处理(利用活动精子的游动能力，即能游过液体界面进入不同的培养液， 从而与死精子、活动能力差的精子、凝集精子、畸形精子、红、白细胞及其他有害成分及杂质 自行分离）： (A1)将液化后的待检测精液均匀分到2支离心管内，然后分别加入待测精液体积2倍的培养基F-10(供应商为:vitrolife); (A2)均匀吹打，混匀，以1200r/min离心lOmin; (A3)弃上清液，再分别加入2ml培养基F-10,将精子沉淀物充分混匀后，1200r/min离心lOmin; (A4)弃上清液，留约0.3ml，将离心管底部的精子沉淀物轻柔地打散，然后将离心 管倾斜，再缓慢沿管壁加入〇 . 5~1.0ml含血清(供应商为:Hyclone) 10% (V/V)的培养基F-10。 (A5)将离心管倾斜45°角，置于37°C，5%C02培养箱内孵育45~60min(此步骤使活 力强的精子能从精子沉淀中向液体斜面上游，并使其获能）；对精液异常者，所述孵育时间 为60min; (A6)取出离心管，吸取0.5ml上清液中云雾状明显的部分(可见上清液的中上层呈 云雾状，即为含较高活力精子的液体），得预处理后的精子； B、显微操作挑取单个精子(此步骤需要使用的仪器和试剂均为市售普通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单精子多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、精子预处理：(A1)将待检测精液液化后分到离心管内，然后加入培养基F‑10；(A2)均匀吹打，混匀，离心；(A3)弃上清液，再在所述离心管中加入培养基F‑10，与精子沉淀物充分混匀后离心；(A4)弃上清液，将所述离心管底部的精子沉淀物轻柔地打散，然后在所述离心管中加入含血清的培养基F‑10；(A5)将所述离心管孵育45～60min；(A6)取出所述离心管，吸取上清液中云雾状明显的部分，得预处理后的精子；B、显微操作挑取单个精子：(B1)在无菌培养皿内制备聚维酮溶液滴，然后用矿物油覆盖；(B2)制作显微针：制作长度为4.5cm～5.5cm的无菌毛细玻璃管，排出所述无菌毛细玻璃管中的气体，得显微针，所述显微针内径为5～8um，两端平整；(B3)调节倒置显微镜，安装所述显微针至所述倒置显微镜上，通过显微操作仪将所述步骤A预处理后的精子移至所述聚维酮溶液滴中，每个所述聚维酮溶液滴移有一个所述步骤A预处理后的精子；(B4)将另一所述显微针套在口吸管上，在体视显微镜下，分别将所述步骤(B3)后含有单个精子的所述聚维酮液滴转移至PCR管中；C、单精子多重PCR：(C1)在每个所述PCR管中加入裂解液裂解，温育；(C2)选择引物进行多重PCR扩增。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，李维娜，卢光琇，
申请(专利权)人：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43