本发明专利技术公开了一种用于检测牛支原体的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针与其在检测牛支原体中的应用。用于牛支原体的实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据牛支原体OPPD/F基因的特异性保守序列设计的，用以定性、定量检测待测样品中的牛支原体，上游引物(OF-A)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(OF-B)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，TaqMan探针(OF-P)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测出牛支原体，为牛支原体的检测提供了新的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽医传染病领域中牛支原体病的检测，特别涉及一种用于检测牛支原体病原的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针与其在检测牛支原体中的应用。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis)属柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属，是目前所知能在无细胞培养基中独立生长、繁殖的最小微生物。1961年美国科学家Hale首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体。1976年首次报道了牛支原体与牛呼吸系统疾病有关。2008年我国首次分离鉴定了能引起肺炎的牛支原体，后陆续在湖北、内蒙、重庆、广西等地分离到该病病原体。牛支原体可以引起牛的肺炎、乳腺炎、生殖道炎症、关节炎、耳炎、角膜结膜炎、流产与不孕等多种病症。牛支原体病是由牛支原体引起的一种可导致多种病症的传染病，主要引起肉牛和奶牛发病，初生犊牛对该病最易感，其中，由牛支原体引起的肺炎称为传染性牛支原体肺炎或牛支原体肺炎，是目前已知的由牛支原体引起的对病畜危害最为严重的一种病症。牛支原体肺炎发病率约为50％-100％，病死率可高达10％-50％，给我国养牛业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了我国养牛业的健康快速发展。现阶段对于牛支原体病的检测方法主要有3大类，即病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测。病原学检测主要是对病原微生物的分离培养以及对病原微生物的染色镜检，由于牛支原体对营养物质的要求较苛刻且培养周期长，在镜下呈多形性且检出率低，所以对于牛支原体病的临床诊断而言，常规病原学检测有太多的弊端。免疫学检测方法应运最为广泛的有酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，大多数ELISA试剂盒均是以全菌蛋白作为抗原进行包被,由于牛支原体的膜蛋白与无乳支原体的表面膜蛋白极为相近,现阶段仍难以找到特异性较强的抗原用于鉴别诊断,而以全菌蛋白作为抗原进行包被的ELISA诊断方法势必存在交叉反应，导致该方法的特异性较差。分子生物学技术的日益发展对于传染病的临床诊断具有重要的意义，目前国内对于牛支原体的分子生物学检测方法应用较多的主要包括多重PCR(multiplexPCR)、套式PCR(nestedPCR)、RT-PCR(reversetranscriptasePCR)等，而牛支原体的实时荧光定量PCR检测方法尚未见报道。实时荧光定量PCR技术(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析(HeidCA,StevensJ,LivakKJ,WilliamsPM.RealtimequantitativePCR.GenomeRes.1996Oct；6(10):986-94.)。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。通过该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA，该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量，在动物病原体基因的检测，畜禽产品的检验检疫，生物制品的鉴定等领域(JozefczukJ,AdjayeJ.Quantitativereal-timePCR-basedanalysisofgeneexpression.MethodsEnzymol.2011；500:99-109.)。oppD/F是寡肽转运ATP结合蛋白质的简称，是牛支原体特异性基因，编码牛支原体2条短肽，根据此基因设计引物进行PCR扩增可以用来鉴别牛支原体和无乳支原体，将oppD/F基因序列在NCBI数据库中利用blast进行比对，结果发现，序列与牛支原体相关序列同源性高达99％，与无乳支原体同源性仅为86％，比对结果中未出现丝状支原体属菌株，进一步证实该引物可用于特异性的鉴定牛支原体。在我国，李媛等参考Hotzel等人的方法，以牛支原体纯培养物为模板建立了巢式PCR检测方法，敏感性试验显示，从1012ccu/mL-101ccu/mL(colorchangeunit，颜色变化单位)的纯培养物DNA中均可扩增出了特异性片段(李媛等.牛支原体套式PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2009,31(9):709-711.)。国外文献显示，使用牛支原体特异性基因编码的DNA聚合酶Ⅲ和牛支原体的特异性插入序列(ISm-bov3基因)为目标基因建立的PCR检测方法可以用于临床上从牛奶及鼻拭子中检测牛支原体特异性序列。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的引物与TaqMan探针，以实现牛支原体的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。本专利技术所提供的一对用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的引物，其上游引物(OF-A)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(OF-B)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。由上述引物衍生的引物序列也属于本专利技术的保护范围。所述衍生序列是指在SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。本专利技术所提供的用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(OF-P)，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本专利技术的保护范围。所述衍生序列是指在SEQIDNO：3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。所述报告荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。本专利技术的第二个目的是提供用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于20μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量PCR反应液PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL(购于TakaRa公司)，ddH2O7.2μL，上游引物OF-A(10μmol/L)0.6μL，下游引物OF-B(10μmol/L)0.6μL，TaqMan探针OF-P(10μm本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的引物，其上游引物(OF‑A)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(OF‑B)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的引物，其上游引物(OF-A)的核苷酸序
列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(OF-B)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所
示。
2.权利要求1所述引物的衍生序列，所述衍生序列是指在SEQIDNO：1和/或SEQID
NO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
3.用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(OF-P)，其核苷酸序列如
序列表中SEQIDNO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’
端标记有淬灭荧光基团。
4.权利要求3所述TaqMan探针的衍生序列，所述衍生序列是指在SEQIDNO：3的基础
上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的TaqMan探针序列。
5.根据权利要求3或4所述的用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针
(OF-P)，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
6.用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物
和权利要求3或4或5所述的TaqMan探针。
7.根据权利要求6所述的用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在
于：所述试剂盒包括以下用于20μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量PCR反
应液PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL，ddH2O7.2μL，上游引物OF-A(10μmol/L)0.6μL，
下游引物OF-B(10μmol/L)0.6μL，TaqMan探针OF-P(10μmol/L)0.6μL。
8.根据权利要求6或7所述的用于对牛支原体进行实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特
征在于：所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛支原体标准株基
因组DNA或携带牛支原体OPPD/F基因的克隆质粒(优选为pMD19-T-OPPD/F)，...
【专利技术属性】
技术研发人员：申之义，魏学峰，李建，纪燕，高航飞，李雪峰，郝雪斌，杜宇荣，王英，刘国英，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
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