实时荧光定量PCR检测Vero细胞DNA残留的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测疫苗半成品、疫苗成品等样品中宿主ＤＮＡ残留量的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术快速、定量检测疫苗半成品、疫苗成品样品中ｖｅｒｏ细胞残留ＤＮＡ的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及定性与定量检测Vero细胞DNA (即非洲绿猴基因组DNA)的试剂盒，特别是涉 及以实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术快速、准确、定量检测疫苗样品中vero细胞残留DNA 含量的试剂盒。
技术介绍
Vero细胞是一种非洲绿猴肾细胞系的传代细胞，具有许多优点与原代细胞相比，它不 含有任何外源污染因子；它可从一个冻存安瓶的细胞通过培养扩增至相当大的量，具有良好 的均一性；第三，原代细胞的获得必须靠手工操作，不适合工业化生产。其次，与人二倍体 细胞相比，Vero细胞使用代次较高，培养更易，有利于大规模培养，所以，Vero细胞被认为 是一种理想的疫苗生产基质，WHO推荐发展中国家用Vero细胞生产疫苗满足防疫需要。然而， 用传代细胞株生产疫苗的一个重要问题是其安全性，表现为具潜在致瘤性的残留细胞DNA(Report of a WHO Study Group. WHO Technical R印ort Series. 1987， 747: 7-25; Griffiths J B. Continuous cell lines as substrates for biological . Bulletin d， information newsletter (International Association of Biological Standardization) 1988， 73: 4-11)， 因此冊O对精制疫苗中残留DNA有严格的限制，如WHO规定精制vero细胞狂犬病疫苗中残余vero 细胞DNA含量不超过100pg/剂量(相当于100pg/ml)。残余vero细胞DNA含量是基于vero细胞生 产的精制疫苗的主要质量控制指标之一，必须进行严格检定并纯化，使含量不能高于规定标 准。由于DNA残留含量的规定非常低，需采用较敏感的核酸杂交技术。而目前用于检測疫苗残 留DNA的方法主要是分子杂交法，如利用随机引物方法，用地高辛(Dig)、酶、生物素或放 射性同位素标记Vero细胞DNA，并制备成DNA探针，以此探针与待测样品总DNA以及已知浓度的 参比样品DNA在硝酸纤维膜上进行点杂交，最后通过显色信号强度来判断样品中DNA含量。使 用该方法，虽然灵敏度可以达到要求，但是操作周期长， 一般需要2—3个工作日；其次，采 用随机引物标记DNA探针的方法，稳定性和重现性较差；而且，通过杂交显色的强度来判定DNA 含量的标准不客观。目前，也有研究报道对传统的随机引物标记探针的方法进行了改进，即 直接用地高辛标记一段特异性的核酸片段制备成探针，但是还是存在周期长，判定DNA含量的标准不客观等因素，因此，迫切需要研究一种快速、准确、敏感和易于操作的检测试剂盒。 实吋荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置 (CCD)的PC时广增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD 能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析 汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et a7. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6):1292-1305; Lie, Y. S.， Petropoulos, C. J. ， Advances in quantitative PCR technology: 5， nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9, 43 - 48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体 系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告 基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩 增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧 光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片 段的扩增而呈现线性增强。与分子杂交方法相比，TaqMan PCR技术应用于定量检测中具有如下优点通过对扩增曲 线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃分子杂交法受多种因素干扰的终点分析方 法，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测疫苗纯化的效果；将DNA扩增与检测 过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大 大縮短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而 减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配 对的荧光探针，有效结合了 PCR和探针杂交的双重特异性，进一步提高了检测目标耙多核苷 酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的分子 杂交方法，在病原体的定量或定性检测中得到十分广泛的应用。美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用 于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批 准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。虽然 已经有用实时荧光PCR技术(染料法)检测CHO细胞残留DNA的报道(Nissom PM. Specific detection of residual CH0 host cell ■ by real-time PCR. Biologicals. 2007, 35(3) :211-5.)，但在疫苗残留DNA的检测中，目前还没有可供快速检测用的荧光PCR检测试剂 盒。因此，现在需要开发一种能够快速检测疫苗中残留DNA含量的试剂盒，满足疫苗生产与质 检等工作的需要。众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析疫苗样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性， 一个关键 性的基本技术环节是如何基于已知的耙多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探 针。本专利技术人将实时荧光定量PCR技术开发了相应的试剂盒应用于非洲绿猴的所有巳知变异体 之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测vero细胞DNA的试剂 盒，特别是本试剂盒可用于检测疫苗样品中vero细胞残留DNA，从而对疫苗生产过程中进行质本试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性 探针，在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg"的PCR反应缓 冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测靶多核苷 酸的目的。本专利技术所提供的检测疫苗样品中vero细胞残留DNA的试剂盒包括(1)分别装有DNA提取 液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管， 和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测疫苗样品中ｖｅｒｏ细胞残留ＤＮＡ含量的试剂盒，该试剂盒包括：（１）分别装有ＤＮＡ提取液、ＰＣＲ扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和（２）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中ＰＣＲ扩增反应液由耐热ＤＮＡ聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、含镁离子的缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向引物和反向引物的序列分别为５’－ＴＴＣ　ＴＴＴ　ＣＣＡＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＣ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＴＡＴ　ＴＴＣ　ＣＴＴ－３’和５’－ＴＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＧＧＣ　ＡＡＡ　ＣＧＧ　ＡＴＡ　ＴＴ－３’，其中正向引物可向５’和３’端方向各延伸５个碱基，反向引物可向５’和３’端方向各延伸５个碱基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓中平，徐伟杰，胡守旺，李明，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]