本发明专利技术公开了一种转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于PCR扩增以及DHPLC分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因棉花检测方法，实现了转基因棉花的多靶标检测。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明专利技术的引物和检测方法为转基因棉花检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因棉花多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法。
技术介绍
目前对转基因棉花的检测方法主要包括常规PCR，实时荧光PCR、PCR-基因芯片等。传统的常规PCR检测方法的扩展性存在一定的局限，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量 扩展。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法,分辨率高、扩展性能好、灵敏度高。该技术在50°C条件下分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与marker比较确定分子量大小，判定是否含有目标检测基因，分辨率高。目前，尚没有转基棉花的PCR结合DHPLC的检测技术(PCR-DHPLC)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测的引物。本专利技术的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因棉花的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术公开了用于转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于所述弓I物包括弓I物对I，以及引物对2、引物对3和引物对4中的至少一对弓丨物；引物对I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；引物对2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq IDNo. 4所示序列；引物对3的上游引物含有Seq ID No. 5所示序列，下游引物含有Seq ID No. 6所示序列；引物对4的上游引物含有Seq ID No. 7所不序列，下游引物含有Seq ID No. 8所不序列；Seq ID No. I :5，-TCCATGCCGCCTCACAAG-3’Seq ID No. 2 :5，-CCCAGCCCTCCAAAGATT-3’Seq ID No. 3 :5’ -TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC-3，Seq ID No. 4 :5，-GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3，Seq ID No. 5 :5，-AACGGGCGGAAACCCTTG-3’Seq ID No. 6 :5’ -GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3，Seq ID No. 7 :5’ -TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG-3’Seq ID No. 8 :5’ -GCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。需要指出的是，上述Seq ID No. I至Seq ID No. 8是与转基因棉花的检测靶标序列互补配对的特异序列，具有很强的特异性识别性。本专利技术中所述的用于转基因大豆的PCR结合变性高效液相色谱技术检测的引物，在本专利技术中作为一个不可分割的整体概念，由多对引物对混合而成，具体来说所述引物包括引物对1，以及选自引物对2-4的至少一对引物。其中，各引物对的特异性是本专利技术所述引物的基础，但本专利技术所述引物的特异性等其它效果，更重要的还体现在其作为一个整体，其中的各引物对之间的理化特性以及PCR扩增产物之间的统一协调，这也是多重PCR扩增中弓I物组合配伍的关键与难点。进一步的，所述引物对1-4的上游引物的5’端还包括Seq ID No. 9所示序列，所述引物对1-4的下游引物的5’端还包括Seq ID No. 10所示序列；·Seq ID No. 9 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 10 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 9和Seq ID No. 10是分别在上游引物和下游引物的5 ’端添加的与检测靶标序列无关的一段序列，该序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是一段随机生成的序列。该序列可以用于调控PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。本专利技术中，优选的，所述引物对I的上游引物具有Seq ID No. 11所示序列，下游引物具有Seq ID No. 12所示序列；引物对2的上游引物具有Seq ID No. 13所示序列，下游引物具有Seq ID No. 14所示序列；引物对3的上游引物具有SeqID No. 15所示序列，下游引物具有Seq ID No. 16所示序列；引物对4的上游引物具有Seq ID No. 17所示序列，下游引物具有Seq ID No. 18所不序列；Seq ID No. 11 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCATGCCGCCTCACAAG-3’Seq ID No. 12 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGACCCAGCCCTCCAAAGATT-3’Seq ID No. 13 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTGAAATTAAAA CCAATGCCAC-3，Seq ID No. 14 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3，Seq ID No. 15 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTAACGGGCGGAAACCCTTG-3’Seq ID No. 16 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3，Seq ID No. 17 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG—3’Seq ID No. 18 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3，。需要说明的是，所述Seq ID No. 11至Seq ID No. 18序列是由上述Seq IDNo. I至Seq ID No. 8序列分别在其5’端添加调控序列而成，尽管上述已经说明Seq ID No. 9和SeqID No. 10所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本专利技术中，需要考虑调控序列与Seq ID No. I至Seq ID No. 8所示序列的理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的Seq ID No. 11至Seq ID No. 18所示序列作为检测引物的整体性能。本专利技术中，更优选的，所述引物对I为检测棉花内源基因sad I基因的引物，引物对2为检测转基因棉花品系M0N531的引物，引物对3为检测转基因棉花品系M0N1445本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于转基因棉花多重PCR?DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括引物对1，以及引物对2、引物对3、引物对4中的至少一个；引物对1的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；引物对2的上游引物含有Seq?ID?No.3所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.4所示序列；引物对3的上游引物含有Seq?ID?No.5所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.6所示序列；引物对4的上游引物含有Seq?ID?No.7所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.8所示序列；Seq?ID?No.1：5’?TCCATGCCGCCTCACAAG?3’Seq?ID?No.2：5’?CCCAGCCCTCCAAAGATT?3’Seq?ID?No.3：5’?TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC?3’Seq?ID?No.4：5’?GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT?3’Seq?ID?No.5：5’?AACGGGCGGAAACCCTTG?3’Seq?ID?No.6：5’?GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC?3’Seq?ID?No.7：5’?TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG?3’Seq?ID?No.8：5’?GCCGAACGCTGTTATCCTCAT?3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章桂明，向才玉，凌杏园，潘广，程颖慧，康林，李鹤遥，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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