【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种表达dspb蛋白的重组细胞及其应用。
技术介绍
1、自然界中的许多微生物倾向于形成多细胞群落，菌落的表面包裹着一层自身合成的多糖、脂质和蛋白质等物质，形成细菌生物膜，以帮助它们在抗菌剂和宿主免疫系统的攻击下生存。存在于植入生物医学设备表面的细菌生物膜通常会引起严重的感染和炎症。如表皮葡萄球菌和大肠杆菌的生物膜通常引起血管内导管相关感染，金黄色葡萄球菌的生物膜通常与金属植入物引起的感染有关。细菌生物膜可以保护细菌不被宿主免疫系统识别和清除，而抗生素类药物由于细菌生物膜的阻碍无法接触到致病菌，达不到预期的杀菌效果。
2、生物膜中的细菌包被于自身合成的细胞外多糖基质中，其主要成分是由β-(1,6)糖苷键连接而成的聚β-(1,6)-n-乙酰葡萄糖胺，使用蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和糖苷酶，破坏细菌形成的生物膜后，细菌很容易接触到抗菌剂并被杀死。糖苷水解酶gh20蛋白能水解n-乙酰氨基葡萄糖残基之间的β-(1,4)糖苷键，而分散蛋白b(dspb)作为糖苷水解酶家族gh20蛋白之一，具有催化降解聚β-(1,6)-n-乙酰葡萄糖胺的β-(1,6)糖苷键的作用。利用dspb蛋白能够降解细菌形成的生物膜，使细菌形成游离状态的细胞，方便机体免疫系统的清除以及抗生素的渗透与扩散。利用dspb与底物结合的特异性并将其与医疗器械相结合，有望为植入医疗器械细菌生物膜感染提供有效的治疗途径。目前蛋白dspb已在大肠杆菌中表达并纯化，对聚β-(1,6)-n-乙酰葡萄糖胺有降解活性，可以实现细菌生物膜的破坏，但是其表达
3、基于此，提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种表达dspb蛋白的重组细胞及其应用，以解决现有技术中在大肠杆菌中表达并纯化得到的dspb蛋白活性低，去除细菌生物膜效率低的问题。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种表达dspb蛋白的重组细胞，所述重组细胞包含dspb蛋白基因以及宿主菌；所述宿主细胞为cho细胞；
4、所述dspb蛋白基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、本专利技术提供了所述的重组细胞的构建方法，包括如下步骤：
6、(1)将dspb蛋白基因插入pb转座子载体中得到重组载体；
7、(2)利用步骤(1)得到的重组载体转染cho细胞，得到转染细胞；
8、(3)使用培养基对转染细胞进行培养，当转染细胞的细胞融合度达到85～95％时，得到表达dspb蛋白的重组细胞；
9、步骤(1)中所述dspb蛋白基因为所述的dspb蛋白基因。
10、优选的，步骤(1)中所述pb转座子载体为ppb-hsa。
11、优选的，步骤(2)中所述转染方法为磷酸钙沉淀法、电转染法、脂质体转染法或pei转染法。
12、优选的，步骤(3)中所述培养基为含有杀稻瘟菌素的dmem-f12完全培养基；所述杀稻瘟菌素在dmem-f12完全培养基中的终浓度为8～17μg/ml。
13、本专利技术提供了所述的重组细胞或所述的构建方法得到的重组细胞在制备去除细菌生物膜的产品中的应用。
14、本专利技术提供了一种dspb蛋白的制备方法，包括如下步骤：
15、(1)将表达dspb蛋白的重组细胞接种到无血清悬浮培养基中培养，当细胞存活率为65～75％时，离心取上清得到上清液；
16、(2)将步骤(1)得到的上清液过滤、纯化、洗脱，得到dspb蛋白；
17、步骤(1)中所述的表达dspb蛋白的重组细胞为所述的重组细胞或所述的构建方法得到的重组细胞。
18、优选的，步骤(1)中所述无血清悬浮培养基为cho无血清悬浮培养基；所述培养的转速为115～125rpm，所述培养的温度为36～38℃，所述培养的co2浓度为4～6％；所述表达dspb蛋白的重组细胞在无血清悬浮培养基中的初始浓度为4～6×105个/ml。
19、优选的，步骤(2)中所述过滤为微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.45μm；所述纯化为镍柱纯化；所述洗脱的洗脱液为含有咪唑的磷酸盐缓冲液，所述咪唑的终浓度为180～220mmol/l。
20、本专利技术提供了所述的制备方法得到的dspb蛋白在制备去除细菌生物膜的产品中的应用。
21、本专利技术具有如下技术效果和优点：
22、本专利技术优化了dspb蛋白基因，使其能够在真核动物细胞中表达，并且能够提高dspb蛋白的表达量。本专利技术提供了一种表达dspb蛋白的重组细胞，重组细胞的构建方法简单，并且能够稳定大量表达dspb蛋白，表达的dspb蛋白的酶活性相比于原核细胞表达的dspb蛋白的酶活性更高，去除细菌生物膜的效果更好。
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1.一种表达DspB蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含DspB蛋白基因以及宿主菌；所述宿主细胞为CHO细胞；
2.权利要求1所述的重组细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述pB转座子载体为pPB-HSA。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述转染方法为磷酸钙沉淀法、电转染法、脂质体转染法或PEI转染法。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养基为含有杀稻瘟菌素的DMEM-F12完全培养基；所述杀稻瘟菌素在DMEM-F12完全培养基中的终浓度为8～17μg/mL。
6.权利要求1所述的重组细胞或权利要求2～5任意一项所述的构建方法得到的重组细胞在制备去除细菌生物膜的产品中的应用。
7.一种DspB蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无血清悬浮培养基为CHO无血清悬浮培养基；所述培养的转速为115～12
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述过滤为微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.45μm；所述纯化为镍柱纯化；所述洗脱的洗脱液为含有咪唑的磷酸盐缓冲液，所述咪唑的终浓度为180～220mmol/L。
10.权利要求7～9任意一项所述的制备方法得到的DspB蛋白在制备去除细菌生物膜的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种表达dspb蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含dspb蛋白基因以及宿主菌；所述宿主细胞为cho细胞；
2.权利要求1所述的重组细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述pb转座子载体为ppb-hsa。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述转染方法为磷酸钙沉淀法、电转染法、脂质体转染法或pei转染法。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养基为含有杀稻瘟菌素的dmem-f12完全培养基；所述杀稻瘟菌素在dmem-f12完全培养基中的终浓度为8～17μg/ml。
6.权利要求1所述的重组细胞或权利要求2～5任意一项所述的构建方法得到的重组细胞在制备去除细菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，张正男，孙秋丽，张玺，王小引，郝小龙，许慧，王冲，潘红福，孙永坤，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：
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