一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法。本发明专利技术是在成功分离到一株免疫原性良好的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)S株作为生产菌株，通过使用高效的培养基，研究出适宜的培养方法、灭活工艺和适宜的免疫佐剂，制造出猪肺炎支原体灭活疫苗，本发明专利技术生产出的灭活疫苗具用于免疫猪后获得良好的免疫保护效力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪的一种传染病预防用灭活疫苗，本专利属于兽用生物制品技术领 域。
技术介绍
猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)，又称猪地方流行性肺炎 (Enzootic pneumoniae of Swine，EPS)，俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性接触性呼吸道传染病，主要症状为表现为咳嗽和气喘，生 长迟缓，饲料转化率低。该病具有发病率高，死亡率低，广泛分布于世界各地，是造成全球养 猪经济损失最重要的疾病之一。 猪肺炎支原体具有典型支原体的全部形态特征，无细胞壁菌体呈多种形态，在电 镜下可以见到球状、环状、丝状及点状的菌体形态。在固体培养基上10~14日可见到菌落， 多为圆形，边缘通常不整齐，半透明，少数中央有乳头状突起，大小在100~300 y m之间。猪 肺炎支原体是当前最难培养的支原体种类之一，其对培养基营养成分和培养条件要求非常 苛刻，在普通培养基上难以生长。要从发病猪体内或病变组织分离猪肺炎支原体是件极其 困难的事，初次分离生长非常缓慢，通常需要10~30日的培养，才能引起培养物颜色发生 变化，而且培养物滴度很低，需经过持续驯化后才能达到较高的活菌滴度，培养时间可缩短 为3~4日。 患病猪是该病最主要传染源，病猪和健康猪混群饲养，常引起本病的传播。各种 年龄的猪均可感染本病，但幼龄仔猪易感性比成年猪高，而且发病症状也更加明显，由此引 起的经济损失也较为严重。在老疫区，患病母猪往往是主要传染源，并将病原体传染给仔 猪，造成该病在猪群中长期的存在。猪支原体肺炎的传播途径主要是直接接触传播和空气 传播两种形式，当患病猪与健康猪直接接触，或同圈饲养的病猪咳嗽时将病原体通过呼吸 道排出体外，健康猪吸入病原体而感染。Goodwin等1966年证明从患有喘气病的猪鼻腔分 泌物中成功分离出猪肺炎支原体（Goodwin RF，Whittlestone P:Enzootic pneumonia of pigs:growth and behaviour of the causal mycoplasma in liquid media. Br J Exp Pathol 1966, 47 (5): 518-524.)。 猪肺炎支原体可单独引起猪发病，也可与其他病原体引起混合感染，包括支原体 (如猪鼻支原体）、细菌（如猪副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌及败血波氏杆菌、巴氏杆菌 等）、病毒（如猪蓝耳病病毒、猪瘟等），甚至包括肺丝虫等寄生虫，在实际生产中，绝大部分 表现出典型猪喘气病的病猪都是混合感染。 对发病猪进行剖检，可发现其主要病变发生在肺脏，通常出现在尖叶、心叶、中间 叶和膈叶的前缘部分，可见到暗红色的肉样病变，与正常肺组织界限清晰。肺部病变部位的 病理变化是结缔组织增生硬化，与相邻正常肺组织齐平或下陷。切割时切面湿润、平滑致 密，类似于鲜嫩的肌肉，气管和支气管中常伴有卡它性分泌物，肺门淋巴结和隔淋巴结常明 显肿大。 该病的防治主要通过疫苗免疫，药物治疗可缓解或减轻疾病症状，降低发病率，但 不能根除病原体，也不能阻止再感染，停药后往往会很快复发，极大地影响养殖的成本。当 前猪支原体肺炎疫苗主要包括弱毒活疫苗和灭活疫苗两种。 截至当前，猪支原体肺炎的防治工作仍是世界上养猪业面临的一个难题。疫苗免 疫是所有预防控制手段中最有效的途径，我国针对猪支原体肺炎疫苗的研宄开始于上世纪 60年代，直到90年代中国兽医药品监察所成功驯化出了一株免疫原性良好的猪肺炎支原 体弱毒疫苗，并研制乳兔组织活疫苗和鸡胚活疫苗，本世纪初江苏农科院研制出了猪支原 体肺炎活疫苗（168株），但以上活疫苗都采用胸腔注射免疫，操作上不易被用户接受，影响 其推广使用。近年来，中国兽医药品监察所又研制出采用鼻腔喷射免疫的猪支原体肺炎活 疫苗（RM48株）。我国在活疫苗上研制上处于领先地位，但在灭活疫苗的研制上则起步较 晚。
技术实现思路
本专利技术的目的是为将成功分离到一株免疫原性良好的猪肺炎支原体野毒株的基 础上，通过使用高效的培养基，研宄出适宜的培养方法、灭活工艺和适宜的免疫佐剂，制造 免疫保护效力良好的猪肺炎支原体灭活疫苗的方法。 本专利技术的实施方案： 1. 一种猪支原体灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有灭活的S株猪支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae)和兽医生物制品允许使用的佐剂；该猪肺炎支原体S株已于 2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 10095。 2.如权利要求1所述一种猪支原体灭活疫苗的生产方法，其特征在于该灭活疫苗 的生产为： (1)疫苗制造用抗原的制备：将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37°C培养 3~6日，当pH值达到6. 9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到 收获菌液制造疫苗； (2)灭活：培养后菌液经0-丙内酯置灭活处理，加入硫柳汞作为防腐剂； (3)配苗： 油剂苗将灭活后菌液与油佐剂（法国赛比克公司）按（V/V)l:l的比例混合，使 用低剪切力乳化制备水成包油包水（w/0/w)双相疫苗。 水剂苗将灭活后菌液与水佐剂（法国赛比克公司），按1:1的比例，搅拌均匀后制 备成水剂灭活疫苗。【具体实施方式】 本品系用猪肺炎支原体S株接种Lps-5培养基，收获培养物，加入适量的佐剂，乳 化后制成。用于预防猪支原体肺炎（俗称猪喘气病）。 1 菌种 (1)制造本品用的菌种为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株，由北 京中海生物科技有限公司分离、鉴定；该猪肺炎支原体，S株，已于2014年12月1日送交北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10095。效力检验用菌种为猪肺炎支原体JN株，由 中国兽医药品监察所提供。 (2)猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae) S株生产用菌种标准 1)形态特性菌体形态为环状、球状、丝状、杆状和点状多形态微生物，无细胞壁， 革兰氏染色阴性。 2)培养特性在Lps-5液体培养基中，置37°C下培养5~10日，培养基pH值下降 0. 5以上，呈现轻度混浊；在固体培养基上，置含C02潮湿环境下37°C培养7~10日，低倍 显微镜下可见支原体菌落。该菌株的菌落为灰白色支原体的菌落形态，大多数菌落边缘整 齐，有少数菌落边缘不整齐，多数菌落中间没有"脐"状特征。 3)血清学特性用代谢抑制试验鉴定。将猪肺炎支原体S株菌液用Lps培养基稀 释至10 4或105颜色变化单位/11^(0^/1^)后，加入等量含10%的抗猪肺炎支原体阳性兔 血清（中国兽医药品监察所提供）（琼脂扩散反应效价多1:16)的Lps-5培养基，同时设不 加阳性血清的猪肺炎支原体培养物对照管，置37°C培养15日，观察培养基颜色变化。对照 管pH值下降0. 5以上，含阳性血清的试管培养基颜色不发生变化或pH值下降本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪支原体灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有灭活的S株猪支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)和兽医生物制品允许使用的佐剂；该猪肺炎支原体S株已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10095。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晔，吴金，冯忠泽，沈青春，李秋菊，魏晶晶，李聪研，孙亚波，宋潇婷，史文艳，
申请(专利权)人：北京中海生物科技有限公司，吉林和元生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11