本发明专利技术涉及一种分离的多核苷酸，所述述多核苷酸可用于制备治疗艾滋病药物；本发明专利技术还涉及一种序列优化的嵌合多核苷酸，包含上述多核苷酸和加长型的gRNA scaffold，所述嵌合多核苷酸可用于制备治疗艾滋病药物；采用本发明专利技术的多核苷酸和序列优化的嵌合多核苷酸进行基因敲除，能显著提升对靶基因CCR5的在靶率，并具有较低的脱靶率，具有优良的艾滋病治疗药物前景。
【技术实现步骤摘要】
用于HIV感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用
本专利技术属于生物技术和基因工程领域，具体涉及用于HIV感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)感染所引起的免疫系统疾病，是一种危害性极大的全球化传染病。HIV以人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击对象，造成免疫功能丧失，从而易患各种疾病，死亡率高达99％-100％。HIV在人体内的潜伏期能长达8-10年，很多HIV感染者在发展成艾滋病患者之前可以无病症的生活，但病毒在人体内始终存在并不可治愈。虽然全世界众多医学研究人员专注于艾滋病的预防和治疗，但至今尚未研制出特效药物，由于HIV的变异极其迅速，因此也还没有可用于预防的有效疫苗。对于HIV感染的治疗，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒载量、获得免疫功能重建和维持免疫功能、提高生活质量，以及降低HIV相关的发病率和死亡率。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviraltherapy，ART)是近年来广泛使用的治疗手段，它有效抑制HIV在体内的复制，减少体内病毒载量，从而延长感染者的寿命，但其花费高昂，患者依从性差，长期治疗容易产生副作用和抗药性，并且一旦中止治疗病情可能快速反弹，最重要的是，ART并不能够根除体内的HIV病毒，达不到根治的效果。而以基因为基础的治疗方法可以持续的抑制病毒从而减少治疗干预措施，是一种非常有前景的治疗方式。对HIV感染基因治疗手段的发展经历了两个阶段。一，基于RNA的治疗方法，即一种下调相关基因表达量的方法，如shRNA、siRNA、反义RNA等。复旦大学(201110182785.5)公开了一种携带特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒表达载体以及在此基础上构建的重组慢病毒及其制备方法，可以应用于艾滋病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。武汉大学(200910062851.8)公开了一种多靶点siRNA重组慢病毒载体，其中针对CCR5和HIV保守基因rev和tat的三靶点siRNA重组慢病毒载体具有最佳的抑制HIV病毒复制的能力，并能克服或延缓病毒逃逸。但上述技术只能达到基因沉默的效果，不能彻底的将基因敲除。二，基于蛋白质的治疗方法，即对相关基因的敲除，如ZFN(ZincFingerNuclease)、CRIAPR/Cas9，TALEN(TranscriptionActivator-likeEffectorNuclease)等。清华大学和北京唯尚立德生物科技有限公司共同申请的专利(201210385677.2)公开了一类调控CCR5和CXCR4的融合蛋白及方法，该方法利用TALEN技术靶向剪切CCR5或CXCR4基因的活性区域，使经过基因编辑后的细胞具备抵御HIV的能力。中国科学院广州生物医药与健康研究院和呼吸疾病国家重点实验室对CCR5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用提出专利申请(201110115680.8)，该技术通过ZFN来失活人诱导多潜能干细胞的CCR5基因，再经过体外定向诱导分化得到CCR5缺失型的造血干细胞。然而TALEN和ZFN基因编辑系统较为复杂，突变效率较低[1]，已经逐步被CRISPR/Cas9技术所代替。CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)-Cas(CRISPR-associatedendonuclease)系统是基因治疗领域的新成员，是一款强大的基因编辑工具。有别于ZFN和TALEN需要研究者根据目的基因设计和生产一对特异性的核酸酶，CRISPR更简单，具有更广泛的适应性。CRISPR系统由一段crRNA和tracrRNA的嵌合体(crRNA-tracrRNAchimera)和一个Ⅱ类CRISPR系统的非特异性的内切核酸酶9(Cas9)组成，其中的RNA嵌合体由一段Cas9绑定序列gRNAscaffold和一段20nt左右的靶向结合目的基因/位点的RNA向导序列(guideRNA，gRNA，或称引导RNA)构成。只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，NHEJ)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。CRISPR/Cas9技术的多样性可允许靶定病毒生命周期的各个阶段[2]，并且介导持续、有效的对抗HIV的基因治疗。比如说，Cas9核酸酶联合一个或多个靶向前病毒的gRNA，可以介导整合病毒基因组的切除；一种经过修饰的核酸酶缺陷型Cas9与转录激活域融合，可定向激活前病毒的基因表达，从而清除体内潜在的病毒。这种技术也可用于定向靶定宿主依赖的因素，如趋化因子辅助受体(chemokinco-receptors)CCR5[1,3-5]和CXCR4(201410770508.X)，从而阻止病毒进入细胞。HIV主要有R5-嗜性和X4-嗜性两种，对应的辅助受体分别为CCR5和CXCR4，R5-嗜性病毒是目前最普遍感染且在感染的前期起主导作用的病毒类型。全球首例HIV感染的治愈发生在“柏林病人”身上，他接受了一名CCR5-Δ32基因突变纯合体捐献者的骨髓移植，此后的五年都没有在其身上检测到HIV病毒的踪迹。2014年，利用ZFN技术对患者CD4+原代T细胞的CCR5基因进行编辑的第一期临床试验获得成功[6]，为HIV的基因治疗带来新的突破。从此，对于HIV进入人体细胞的主要趋化因子辅助受体——CCR5的基因编辑策略受到更广泛的关注。HyunJanKang[4]等利用CRISPR/Cas9技术编辑诱导型多能干细胞的CCR5基因，筛选出CCR5突变纯合子并诱导分化成造血细胞(包括巨噬细胞)，证明了诱导的造血细胞具有特异性抵抗R5嗜性病毒的能力。来自南京大学模式动物研究所的黄行许(201410149287.4)公开了CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及能够精确靶向人CCR5基因并且实现基因敲除的sgRNA。自CRISPR/Cas9技术面世以来，该技术已经成为国内外基因治疗研究的热点。到目前为止，国内外已有很多科学家投身于CCR5基因敲除的研究，但是离临床应用还有很长的距离。CRISPR/Cas9技术对基因敲除的有效性已经得到广泛的验证，目前急需要解决的是如何降低CRISPR/Cas9的脱靶效率，以确保临床使用的安全性。在对CRISPR/Cas9技术应用的研究中，gRNA的设计一度成为研究的重点和难点，国内外许多实验室和科学家投身于这一课题的研究[7-9]，开发出多种在线或离线设计gRNA的软件。对于gRNA的设计，即靶序列的选择，必须满足两个条件：(1)靶序列的上游或下游具有PAM(protospacer-adjacentmotif)，因为Ca9对靶序列的识别有一个要求，就是结合位点附近必须有PAM区域，而来源不同的Cas9对P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，编码用于HIV感染基因治疗的引导RNA，其特征在于所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
2016.04.11 CN 20161022013581.一种分离的多核苷酸，编码用于HIV感染基因治疗的引导RNA，其特征在于所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸编码的RNA序列如SEQIDNO.8所示。3.一种表达载体，含有权利要求1所述的多核苷酸。4.权利要求1所述的多核苷酸在制备治疗艾滋病药物中的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其中包括将编码所述引导RNA的多核苷酸与编码另一个或几个引导RNA的多核苷酸结合使用，所述编码另一个或几个引导RNA的多核苷酸具有选自如SEQIDNO.1,SEQIDNO.2,SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的DNA序列。6.根据权利要求5所述的用途，其中如SEQIDNO.3所示的...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗思施，李颖，
申请(专利权)人：广东赤萌医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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