一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法，属于酶工程技术领域。本发明专利技术提供了一种序列如SEQ ID NO.2所示的阿魏酸酯酶基因及高效表达阿魏酸酯酶的工程菌，本发明专利技术构建的基因工程菌，具有高效的表达能力，分泌表达的阿魏酸酯酶的酶活最高可达39.9U/mL，为今后工业化生产高活性的阿魏酸酯酶提供了思路和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法，属于酶工程

技术介绍
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulicacidesterase，FAE)又称为肉桂酸酯酶，属羧酸酯水解酶的亚类之一，是指能够水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连接的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。1991年，首次从橄榄色链霉菌(Streptomycesolitrochromogenes)中分离得到阿魏酸酯酶，目前已有超过30种阿魏酸酯酶被分离和纯化。阿魏酸酯酶来源广泛，普遍存在于真菌、细菌、植物中，绝大多数阿魏酸酯酶是从真菌尤其是曲霉菌属(Aspergillussp.)中分离得到，如黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)和构巢曲霉(A.nidulans)等。然而，由于大多数野生菌株产阿魏酸酯酶能力很低，如黑曲霉发酵后酶活仅在10-96mU/mL之间，这就限制了该酶的产业化应用。基因的外源表达可以实现目的蛋白的高效生产。很多科研工作者将不同来源的阿魏酸酯酶基因导入适宜的表达体系中，以构建高产阿魏酸酯酶的重组工程菌。2001年，Juge等在毕赤酵母中实现了黑曲霉阿魏酸酯酶基因的异源高效表达，重组阿魏酸酯酶表达量为300mg/L。在国内，张帅兵等将黑曲霉阿魏酸酯酶基因导入毕赤酵母GS115中，分泌表达的重组阿魏酸酯酶酶活达16.6U/mL。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供含有所述基因的载体或细胞系。本专利技术的第三个目的是提供所述基因编码的阿魏酸酯酶。本专利技术的第四个目的是提供一种产阿魏酸酯酶的基因工程菌，是以pPICZαA为载体，以毕赤酵母X-33为宿主，表达所述阿魏酸酯酶基因。本专利技术的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将SEQIDNO.2所示基因与载体连接，再转化至宿主细胞中。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体是pPICZαA。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主是毕赤酵母X-33.本专利技术的第六个目的是提供一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法，是将基因工程菌接种至BMMY培养基中，200～280rpm培养3～8d。在本专利技术的一种实施方式中，所述BMMY培养基每L含有：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10-4g生物素，100mMpH6.0磷酸盐缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括每20～24h补充终浓度为10mL/L的甲醇。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以活化后的菌体进行接种；所述活化是在BMGY培养基中进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述活化是将菌体接种于BMGY培养基中，于250-300rpm，30℃培养16-18h，至OD600达到2.0-6.0，离心菌体并用BMMY培养基将菌体沉淀重悬，使菌体的OD600为1.0，进行接种。本专利技术还提供所述阿魏酸酯酶在食品、保健品、医药、化工领域的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括制备具有药用价值和保健功能的游离阿魏酸，制备功能性的食品，制备抗氧化剂、香精、香料。有益效果：本专利技术提供了一种阿魏酸酯酶基因及高效表达阿魏酸酯酶的工程菌，利用本专利技术的优化方法构建的工程菌，均具有高效的表达能力，分泌表达的阿魏酸酯酶的酶活最高可达39.9U/mL，为今后工业化生产高活性的阿魏酸酯酶提供了思路和方法。附图说明图1为AnfaeA基因的琼脂糖电泳检测图；M，marker；1,基因opAnfaeAI；2，基因opAnfaeAII；图2为pMD19-AnfaeA双酶切的琼脂糖电泳检测图；M,marker；1，pMD19-AnfaeA双酶切产物；图3为SDS-PAGE电泳图谱；M，marker；1，FaeA-optI；2，FaeA-optII；图4为FaeA-ori、FaeA-optI和FaeA-optII三株重组菌诱导发酵生产reAnfaeA的效果。具体实施方式PDA平板培养基：去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然改良马丁培养基(每L含有)：蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，pH6.4±0.2。LB培养基(每L含有)：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g。YPD培养基(每L含有)：蛋白胨20g，酵母浸出粉10g，葡萄糖20g。BMGY培养基(每L含有)：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10-4g生物素，100mMpH6.0磷酸盐缓冲液，10mL甘油。BMMY培养基(每L含有)：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10-4g生物素，100mMpH6.0磷酸盐缓冲液，10mL甲醇。阿魏酸酯酶的酶活测定方法：以阿魏酸甲酯为底物，配置标准酶活反应体系：移取900μL阿魏酸甲酯(1mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液配制)于1.5mLEP管中，50℃保温5min，加入100μL适当稀释的酶液，准确反应10min后加入400μL冰乙酸终止反应，过膜(水系，0.22μ.)，用高效液相色谱法测定经reAnfaeA水解所产生的阿魏酸的含量。以预先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液的反应物为对照。酶活定义：每分钟降解阿魏酸甲酯生成1μmol阿魏酸所需的阿魏酸酯酶的酶量定义为一个酶活力单位U。表1.引物、序列及酶切位点实施例1将黑曲霉(Aspergillusniger)CBS513.88在PDA平板培养基上划线活化，28℃培养7～14d收集上层孢子至生理盐水中，振荡，制成孢子悬液，取菌悬液接种至改良马丁培养基中，摇床上150rpm，28℃培养3d后纱布过滤培养液搜集白色菌丝体；采用无菌生理盐水冲洗2-3次，12000rpm离心10min，吸取上清液，底部菌丝体收集备用。将菌丝体用5mL研磨器液氮研磨过后，放入灭菌的2mL微量离心管中。使用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取黑曲霉基因组，方法见试剂盒说明书。设计引物(表1)，以提取的A.niger染色体基因组为模板，用表1中的引物组合(F1+R1，F2+R2)分别扩增外显子1和外显子2，PCR反应条件如下：95℃4min预变性后95℃15s，52℃15s，72℃30s共进行30个循环，最后72℃延伸10min。胶回收PCR产物外显子1和外显子2。以外显子1和2的胶回收产物的混合物(1∶1)为模板，以F1和R2为上、下游引物，进行重叠延伸PCR，反应条件除了延伸时间改成60s外，其余条件均和外显子1扩增的条件相同。胶回收重叠延伸PCR产物。并连接pMD19-T载体，保存到E.coliJM109中，在含有50μg/mL氨苄的LB平板上37℃培养1-2d，挑选阳性转化子PCR验证后获得重组质粒pMD19-AnfaeA，由上海生工进行测序，基因序列如SEQIDNO.1所示。实施例2对SEQIDNO.1所示基因进行随机突变，获得序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示基因opAnfaeAI和opAnfaeAII。将SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示基因与载体pMD19-T连接，获得质粒pMD19-opAnfaeAI和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿魏酸酯酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种阿魏酸酯酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.含有权利要求1所述基因的载体或细胞系。3.权利要求1所述基因编码的阿魏酸酯酶。4.一种产阿魏酸酯酶的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，表达权利要求1所述阿魏酸酯酶基因。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以pPICZαA为载体，以毕赤酵母X-33为宿主。6.权利要求5所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，将SEQIDNO.2所示基因与载体pPICZαA连接，再转化至宿主细胞中。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：陆健，蔡国林，李兵，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32