一种固体发酵生产阿魏酸酯酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种固体发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括制备种子液、接种和发酵，所述发酵的菌种为黑曲霉(Aspergllus?niger)CGMCC?No.6152；所述发酵的培养基由碳源、氮源、无机盐和无菌水组成，其中碳源为麸皮、玉米棒粉、豆粕和稻草粉中的至少一种。本发明专利技术所生产的阿魏酸酯酶的酶活力高，且发酵所采用的原料不需要经过特殊的前处理，直接利用农业副产物发酵，工艺简单，降低了生产成本的同时减少了污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产阿魏酸酯酶的方法，尤其涉及。
技术介绍
阿魏酸酯酶又称肉桂酸酯酶，是一种羧酸酯酶，能够水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，从而将阿魏酸游离出来。利用阿魏酸酯酶来处理植物性原料在食品、饲料和造纸等工业生产中有着光明的前景，阿魏酸酯酶已成为近年来的研究热点。植物细胞壁是一个由多糖网络组成的三维结构图，这些多糖包括纤维素，半纤维素，木质素等，它们之间通过羟基肉桂酸类酯键相连，所以在植物细胞壁中存在大量的酚酸化合物。在食品工业中通过运用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁，可以得到大量酚酸化合物。由于酚酸化合物具有抗氧化、清除人体的自由基、抗紫外线、抑菌及抗病毒等作用，已愈发的受到人们的关注，广泛的应用于医药、化妆品和食品添加剂等方面，尤其是阿魏酸，它不仅可以作为抗氧化剂，还具有如抗血栓、抗癌等一些生理作用，同时它还可以作为合成香兰素的前体。在饲料工业中，阿魏酸酯酶可以打破半纤维素和木质素之间相互的交联，从而使细胞壁的机构变得疏松，因此阿魏酸酯酶可以作为添加剂使用。阿魏酸酯酶加快动物对食物的降解速度，同时还能提高动物对饲料的消化程度，并减少随粪便排出的营养物质的流失，从而提高动物对饲料的利用率。在造纸工业中，使用阿魏酸酯酶可以部分的去除木质素，减少制浆工序化学药品如化学漂白剂的使用量，增加了纸浆的白度，使纸的质量得到进一步的提闻。据不完全统计，每年产生农作物秸杆(小麦杆、玉米棒、稻草杆等资源)7. O亿吨，农作物加工厂的废弃物也达I. 5亿吨，如何进一步利用它们，使它们变废为宝，已成为当今研究的热点。阿魏酸酯酶的来源非常的广泛，自从人们第一次在橄榄色链霉菌的培养物中，发现了阿魏酸酯酶可以从麦麸中释放阿魏酸后，迄今为止已经在黑曲霉、侧孢霉及链霉菌等多种微生物的胞外酶中分离得到了阿魏酸甲酯。目前阿魏酸酯酶的生产主要采用液体发酵，但阿魏酸酯酶的酶活普遍较低，同时与固体发酵相比，液体发酵的发酵周期较长，成本较高，发酵条件要求也高。公开号为CN 101200712A的中国专利文献报道了采用固态发酵方法来生产阿魏酸酯酶，取得了不错的效果，但酶活仍然较低，而且发酵所采用的农副产品原料需要先经过汽爆处理后再进行发酵，无形中带来了能耗。
技术实现思路
本专利技术提供了，解决了现有工艺产酶酶活低，发酵原料需经特殊前处理的问题。，包括制备种子液、接种和发酵，所述发酵的菌种为黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No. 6152 ;所述发酵的培养基由碳源、氮源、无机盐和无菌水组成，其中碳源为麸皮、玉米棒粉、豆柏和稻草粉中的至少一种。发酵用的菌种影响产酶能力，本专利技术所用的菌种黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No. 6152是一株高酶活菌株，该菌株是通过对一株分离自土壤中的产酶活较高的菌株进行Y-射线诱变，筛选得到。该菌株分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株号为ZJUQH2012147，该菌株于2012年05月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6152。本专利技术培养基采用麸皮、玉米棒粉、豆柏和稻草粉等作为碳源，除为菌体生长提供必需的能量外，还含有大量酯化阿魏酸，适于生产阿魏酸酯酶。可以选用以下几种组合形式1、玉米棒粉和麸皮；2、玉米棒粉和豆柏；3、麸皮、玉米棒粉和稻草粉。最好选择玉米棒 粉和麸皮的混合，重量比为I : 2 2 I。为了菌种与基质混合均匀，在发酵之前，需先制备种子液，所述制备种子液的方法为将黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No. 6152培养产孢后，用水洗下孢子制成孢子悬液，浓度一般为IO6 IO7个/mL。将孢子悬液按照体积比为I 5%的接种量接种到液体种子培养基中，在转速为150 200r/min的摇床上振荡培养，温度一般为28 30°C，时间一般为15 20h。其中，种子液培养基可以选用PDA培养基。种子制备好后即可进行发酵，将制好的种子液接种到固体发酵的培养基中，混匀后发酵，接种量一般为O. I ImL种子液/5g培养基，发酵的温度为25 30°C，时间4 7天。完成本专利技术目的的关键在于选择合适的菌株和碳源，而发酵的培养基的其余成分可以是常规选择，其中氮源可以选用蛋白胨、酵母膏等，也可以选择无机氮源，无机盐中应包含必要的矿物元素，如钠、钾、镁、钙等。优选的，以重量份计，所述发酵的培养基组成为碳源2 5份、氮源O. I 0.4份、无机盐O. I O. 2份、水15 20份。其中的无机盐由KH2P04、Na2HPO4 · 7H20、NaCl、MgSO4 · 7H20 和 CaCl2 组成；更优选的，以重量份计，所述无机盐组成为=KH2PO4O. 08 O. 12份、Na2HPO4 · 7H20 O. 06份、NaClO. 001 份、MgSO4 · 7H20 O. 002 份，CaCl2O. 0005 份。为了便于存储和使用，发酵完成后，可将发酵培养物干燥，一般于35 45°C气流下烘干至含水量低于10%，粉碎制成粉末状。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为(I)本专利技术所生产的阿魏酸酯酶的酶活高，是现有固体发酵条件下报道的10 30倍，而且较现有阿魏酸酯酶耐热，温度达到40°C，另外最适pH为5. 5。(2)本专利技术所采用的原料不需要经过特殊的前处理，直接利用农业副产物发酵，工艺简单，降低了生产成本的同时减少了污染。(3)本专利技术对固体发酵工艺进行了系统优化，获得了适合工业化生产的培养条件和技术参数。具体实施方式一、培养基斜面培养基新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH自然。液体种子培养基新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然。初筛培养基KH2P043g,Na2HPO4·7Η20 6g，NaCl O. lg，蛋白胨 8g，MgS04 ·7Η20 0. 2g，CaCl2O. 05g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，无菌的含阿魏酸甲酯的二甲基甲酰胺溶液(质量体积比为10% )0. 3ml, pH自然。复筛培养基豆柏20g, KH2P043g, Na2HPO4 · 7H20 6g，NaCl 0. lg,蛋白胨 8g，MgSO4 · 7H20 0. 2g, CaCl2O. 05g，蒸馏水 1000ml, pH 自然。 二、菌株的分离纯化从造纸厂、豆柏加工厂、小麦地和酒厂的土壤样品中采集到50份样品先经增殖培养基培养120h,稀释涂布于察氏培养基平板形成单菌落,再挑选50个菌落点种于初筛培养基上，选择显示白色透明圈的菌落进行摇瓶复筛，得到一株产酶活最高的菌株为W1，测定发酵液阿魏酸酯酶活力(此菌种28°C培养120小时酶活达到162. 84U/L)。经Y -射线诱变(剂量700Gy)，分别稀释菌液10倍、IO2倍、IO3倍，IO4倍、IO5倍、IO6倍，然后涂布菌液于初筛培养基，培养适当时间，挑选产生白色透明圈的菌落于摇瓶复筛(采用复筛培养基培养)，培养168小时后测定阿魏酸酯酶酶活，获得一株酶活最高菌株，命名为ZJUQH2012147，其酶活达到 2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固体发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括制备种子液、接种和发酵，其特征在于，所述发酵的菌种为黑曲霉(Aspergillus？niger)CGMCC？No.6152；所述发酵的培养基由碳源、氮源、无机盐和无菌水组成，其中碳源为麸皮、玉米棒粉、豆粕和稻草粉中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种固体发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括制备种子液、接种和发酵，其特征在于，所述发酵的菌种为黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No. 6152 ;所述发酵的培养基由碳源、氮源、无机盐和无菌水组成，其中碳源为麸皮、玉米棒粉、豆柏和稻草粉中的至少一种。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，以重量份计，所述发酵的培养基组成为 碳源2 5份、氮源O. I O. 4份、无机盐O. I O. 2份和水15 20份。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述氮源为蛋白胨。4.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述无机盐由KH2P04、Na2HPO4· 7H20、NaCUMgSO4 · 7H20 和 CaCl2 组成。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，以重量份计，所述无机盐组成为KH2PO4O. 0...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，徐腾洋，董亚晨，何国庆，方若思，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：