一种菊酯类农药降解酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及农药降解酶的制备方法技术领域，尤其涉及一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤：1）以重组大肠杆菌{E.coliBL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在-86℃的温度下保存；2）种子培养；3）发酵培养；4）补料发酵培养；5）乳糖诱导；6）酶粉制备。本发明专利技术采用重组大肠杆菌高效表达菊酯类农药降解酶，最终制得的降解酶酶粉产量25~40g/L，酶粉酶活为48000~60000U/g，大大提高了菊酯类农药降解酶的产量，降低菊酯类农药降解酶的使用成本，为规模化生产菊酯类农药降解酶提供了一条有效、经济、可行的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农药降解酶的制备方法
，尤其涉及。
技术介绍
菊酯类农药是广谱性杀虫剂，具有速效、高效、低毒、低残留的特点，对140多种害虫的防治有特效。然而，用农药对农作物进行害虫防治时将使农作物的表面或多或少残留一些农药，尤其是菊酯类农药降解速度慢，不仅对人体健康造成危害，而且对生态系统也造成一定的影响。为此，人们采用微生物对农药进行降解，而微生物对农药的作用方式多样，多数属于通过酶促反应降解农药。 中山大学的刘玉焕等通过(一种新型酯酶及其应用，ZL201010547206. 8)中的高通量功能筛选的方法克隆了Sp.ZD112中具有菊酯类农药降解能力的新基因est825，构建了重组表达的大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)/pET-28a_est825，酶学性质研究发现，通过此重组大肠杆菌生产的重组酶在常温下对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分别达到80. 82%, 82. 98%, 69. 23%和69. 65%，菊酯类农药降解酶降解效率高、安全无毒、环境适应强，具有良好的应用前景。目前，国内外已出现通过构建基因组文库克隆一个菊酯类农药降解酶的新基因，并构建能高效表达该基因的工程菌等相关研究，如山东农业大学的闻艳春等(一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解，中国环境科学，1999，19(5))将抗性尖音库蚊五带亚种的抗有机磷农药基因克隆到质粒pRL-439中，获得高酶活工程菌，表达的酶对两类难降解农药(有机氯、菊酯类)可降解90%以上，但未提及产酶量；中国科学院动物研究所的乔传令等(一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用，ZL200410042712. 6)分别克隆解毒酯酶和水解酶基因，将此基因分别克隆到表达载体PETDuet-I上，构建融合表达载体pETDuet-bl-opd，最后转化得到重组菌株并进行诱导培养，该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药，但未提及降解率及产酶量；Heidari Rama等(Hydrolysis of pyrethroids bycarboxylesterases from Lucilia cuprina and Drosophila melanogaster with activesites modified by in vitro mutagenesis, Insect Biochemistry and MolecularBiology, 2職，35(6) :597飞09)通过基因突变技术改变来源于绿蝇与家蝇的羧酸酯酶的活性位点，使得该酶对顺、反式菊酯类农药的降解能力比野生的提高很多倍，而且突变位点不同，也会影响其对顺、反式菊酯类农药的降解能力。Stok Jeanette E等(Identification,expression, and purification of a pyrethroid-hydrolyzing carboxylesterase frommouse liver microsomes, Journal of Biological Chemistry, 279 (28):29863 29869)从小鼠肝微粒中克隆了 I个能降解菊酯类农药的羧酸酯酶基因，并在杆状病毒中表达、纯化，还研究该酶对顺、反式菊酯类农药的催化常数，又从小鼠的肝微粒CDNA文库中筛选分离第2个水解菊酯类农药的羧酸酯酶基因。然而，目前国内外暂缺有关采用基因工程菌高密度发酵技术高效生产菊酯类农药降解酶的技术，因此本领域迫切需要开发高产菊酯类农药降解酶的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供，该制备方法利用重组大肠杆菌高效生产菊酯类农药降解酶。本专利技术是通过以下技术来实现的。 ，包括以下步骤 O以重组大肠杆菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在_86°C的温度下保存； 2)种子培养将甘油管中的生产菌种按2 4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为20(T220r/min、温度为37°C、培养时间为8 IOh的培养条件在恒温摇床中培养；在重组大肠杆菌的发酵过程中，质粒稳定性对产物表达非常重要，在较高的温度如37°C下，重组大肠杆菌的质粒稳定性较高。3)发酵培养将培养好的种子液以2 5%的接种量接入装有3. 75^4. 5L发酵培养基的7. 5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24 28h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20% 25% ;本专利技术的发酵规模不限于7. 5L，可根据实际需要适当扩大发酵规模。4)补料发酵培养发酵培养4 6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为O. Γθ. 21Γ1，补料发酵培养阶段持续的时间为l(Tl4h ;混合补料液通过流加的方式补充，补料速率以能够维持菌体生长的及表达菊酯类农药降解酶所需、且以维持发酵系统中较稳定的溶氧和PH值为依据设定，保证重组大肠杆菌的发酵营养源。5)乳糖诱导补料发酵培养至菌体的OD6tltol值达到10(Γ140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5lg/L，将温度降至3(T35°C开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4)中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为f2g/L，乳糖诱导的时间持续8 10h ；采用乳糖诱导具有成本低、环保、对人体无害的优点。6)酶粉制备发酵结束后，在4 8°C的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6. 5^7. O的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15°/Γ20%的菌悬液，将菌悬液在4°C的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4°C的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。其中，所述步骤2)中，所述摇瓶种子培养基的pH为7. 0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素5(Tl00mg/L。其中，所述步骤3)中，所述发酵培养基的pH为6. 8，所述发酵培养基包括以下组分甘油 5 8g/L，蛋白胨 3 10g/L，酵母粉 3 8g/L，(NH4)2SO4 5 10g/L，MgSO4·7Η20 I 3g/L, KH2PO4 3. 4 6. 85g/L, K2HPO4.12H20 5. 68 11. 35g/L,微量元素液 I 2mL/L，卡那霉素5(Tl00mg/L。本专利技术采用甘油、蛋白胨和酵母粉等原料进行生产，适于大规模生产。其中，所述微量元素液包括以下组分=CaCl2 2. 0g/L, ZnSO4-7H20 5. 0g/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L, (NH4) 6Mo7024 ·4Η20 0. lg/L。其中，所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0.22 μ m的滤膜过滤除菌后的微量元素液。其中，所述步骤3)具体为发酵培养将培养好的种子液以2 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）以重组大肠杆菌{E.coli？BL21(DE3)/pET？28a？est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在？86℃的温度下保存；2）种子培养：将甘油管中的生产菌种按2~4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为200~220r/min、温度为37℃、培养时间为8~10h的培养条件在恒温摇床中培养；？3）发酵培养：将培养好的种子液以2~5%的接种量接入装有3.75~4.5L发酵培养基的7.5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24~28h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20%~25%；4）补料发酵培养：发酵培养4~6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为0.1~0.2h？1，补料发酵培养阶段持续的时间为10~14h；5）乳糖诱导：补料发酵培养至菌体的OD600nm值达到100~140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5~8g/L，将温度降至30~35℃开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4）中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为1~2g/L，乳糖诱导的时间持续8~10h；6）酶粉制备：发酵结束后，在4~8℃的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6.5~7.0的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15%~20%的菌悬液，将菌悬液在4℃的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4℃的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄皓，罗华建，刘玉焕，梁卫驱，胡珊，刘远星，罗诗，莫忠兴，李艳芳，陈仕丽，徐匆，
申请(专利权)人：东莞市农业科学研究中心，中山大学，
类型：发明
国别省市：