本发明专利技术公开了一种人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，本发明专利技术利用含有荧光基团与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化修饰基团的多肽为底物，将荧光强度与Sirtuin5的酶活性关联起来，FRET效应可以使底物琥珀酰化赖氨酸这一Sirtuin5识别位点位于底物的中部，这样一来，使得底物多肽更接近于Sirtuin5的天然底物，结合更紧密 ；可以给予更多选择的荧光基团，得到更可靠的筛选结果。这样的方法可应用于Sirtuin5调节剂的筛选，或是生物样本中的Sirtuin5活性检测，具有微型化、自动化、快速可靠等特点，适用于高通量的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药学领域，尤其是一种人源沉默信息调节因子5(Sirtuin5或SIRT5) 的活性荧光检测方法。
技术介绍
组蛋白去乙酰化酶是一类催化各种底物蛋白赖氨酸残基侧链的乙酰基水解的蛋 白酶家族。目前发现的人源的组蛋白去乙酰化酶包括4个亚类共18个亚种。按催化机理 的不同，它们分为经典的I类、II类和IV类以锌为辅酶的组蛋白去乙酰化酶（HDAC，有11 种分别是HDAC1 到HDAC11); 另外，比较特殊的III类以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)为辅酶的组蛋白去乙酰化酶，也叫 做沉默信息调节因子（Sirtuin，有7种分别是SIRT1到SIRT7)。根据蛋白序列的相似性以 及进化分类，所有物种的Sirtuin又被分成四大类：SIRT1，SIRT2，SIRT3属于I类；SIRT4 属于II类；SIRT5 属于III类；SIRT6 和SIRT7 属于IV类 〇 研宄表明，HDAC抑制剂可以抑制肿瘤细胞的生长、促进其分化及凋亡，而对正 常细胞几乎没影响。因此，它们已成为新一代明星靶向抗癌药物，目前多种HDAC抑制 剂正处于临床前期和临床试验中oVorinostat和FK228 已被美国FDA 分别于2006年和2009年批准用于治疗难治性的皮肤T细胞淋巴瘤。已上市的这两个药物都 是机理型的HADC抑制剂，但它们都不是选择性地只抑制某一个HDAC。这有可能导致这两 个药物在治疗过程中会带来的一些副作用，如疲劳、恶心、腹泻、肺栓塞和血小板减少等，甚 至极个别的心脏毒性〇 相对于HDAC抑制剂，Sirtuin抑制剂的抗肿瘤研宄相对滞后，报道的不多。目前只有一个针 对Sirtuin的非特异性抑制剂（EX-527)在欧洲进入一期临床研宄 〇 Sirtuin抑制剂开发相对滞后的主要原因在于，在这四大类的Sirtuin当中，仅有 I类Sirtuin(即SIRT1，SIRT2和SIRT3)具有显著的去乙酰化酶活；而其他的II、III、IV类Sirtuin(SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7)的去乙酰化酶活则是非常微弱。对于这些仅具有微 弱去乙酰化活性的Sirtuin来说，我们很难开发出可靠的Sirtuin活性筛选方法去开发它 们的调节剂。 近期的最新研宄成果表明，III类Sirtuin(SIRT5)是NAD依赖的去丙二酰 化和去瑭泊酰化酶（NAD-dependentdemalonylaseanddesuccinylase) 〇 根据SIRT5去琥珀酰化和去丙二酰化活性的这一最新研宄结果，已开发出香 豆素偶联多肽的荧光底物并建立了相关的SIRT5的活性检测方法。然而，这些方法依赖的香豆素只能连接在多肽的C端，使 得底物琥珀酰化(或丙二酰化）赖氨酸这一SIRT5识别位点只能位于C端，从而导致了底物 多肽与SIRT5的亲和力下降，另一方面，香豆素基团还可能给后续的药物筛选带来一些误 导。 因此，SIRT5的新型活性检测方法亟待研宄和开发。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，它的 筛选效果更准确，且简单易行，成本低廉，以克服现有技术的不足。 本专利技术是这样实现的：人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，以含有荧 光基团与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊二酰化修饰基团 的多肽为底物，1)将所述底物与人源沉默信息调节因子5孵育，脱去底物的赖氨酸残基上 的琥珀酰化(丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊二酰化)修饰，得到无修饰的赖氨酸多肽；2)将 所述的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育，从赖氨酸的C端裂解肽键；使荧光 强度与上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到的荧光强度与人源沉默信息调节 因子5的酶活性具有相关性。 所述的以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化或 羟甲基戊二酰化修饰基团的多肽为底物具有如下结构式：【主权项】1. 一种人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，其特征在于：以含有荧光基团 与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊二酰化修饰基团的多肽 为底物，1)将所述底物与人源沉默信息调节因子5孵育，脱去底物的赖氨酸残基上的琥珀 酰化、丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊二酰化修饰，得到无修饰的赖氨酸多肽；2)将所述的 无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育，从赖氨酸的C端裂解肽键；使荧光强度与 上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到的荧光强度与人源沉默信息调节因子5 的酶活性具有相关性。2. 根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，其特征在于： 所述的以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊 二酰化修饰基团的多肽为底物具有如下结构式：式中，Rl及R2均表示3个以上氨基酸；所述的多肽为通过肽键相连的3个以上的氨基 酸；在该氨基酸序列中没有无修饰的赖氨酸或者精氨酸，且琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化 或羟甲基戊二酰化赖氨酸残基不能位于多肽的两端。3. 根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，其特征在于： 所述的配对的荧光基团和荧光淬灭基团包括Edans/Dabcyl、Trp/Dansyl、Trp/DNP、MCA/ DNP,Abz/DNP或Abz/Tyr(NO2)。4. 根据权利要求I所述的人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，其特征在于： 所述的蛋白水解酶裂解液为蛋白质裂解液其有效成分为胰蛋白酶、羧肽酶或gluc-C。5. 根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，其特征在于： 所述底物与人源沉默信息调节因子5的体积比为10:1，孵育时间为30分钟；所得的无修饰 的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液的体积比为10 :1，孵育时间为1小时；上述的孵育温度 为 25-37 °C。【专利摘要】本专利技术公开了一种人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，本专利技术利用含有荧光基团与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化修饰基团的多肽为底物，将荧光强度与Sirtuin5的酶活性关联起来，FRET效应可以使底物琥珀酰化赖氨酸这一Sirtuin5识别位点位于底物的中部，这样一来，使得底物多肽更接近于Sirtuin5的天然底物，结合更紧密 ；可以给予更多选择的荧光基团，得到更可靠的筛选结果。这样的方法可应用于Sirtuin5调节剂的筛选，或是生物样本中的Sirtuin5活性检测，具有微型化、自动化、快速可靠等特点，适用于高通量的应用。【IPC分类】G01N33-68【公开号】CN104714024【申请号】CN201410641121【专利技术人】何彬, 李燕, 刘亭, 李勇军, 兰燕宇, 王爱民, 王永林 【申请人】贵阳医学院【公开日】2015年6月17日【申请日】2014年11月13日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源沉默信息调节因子5的活性荧光筛选方法，其特征在于：以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且带有琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊二酰化修饰基团的多肽为底物， 1）将所述底物与人源沉默信息调节因子5孵育，脱去底物的赖氨酸残基上的琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化或羟甲基戊二酰化修饰，得到无修饰的赖氨酸多肽；2）将所述的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育，从赖氨酸的C端裂解肽键；使荧光强度与上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到的荧光强度与人源沉默信息调节因子5的酶活性具有相关性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何彬，李燕，刘亭，李勇军，兰燕宇，王爱民，王永林，
申请(专利权)人：贵阳医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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