突变型p53基因反义表达载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种突变型ｐ５３基因反义表达载体及其制备方法，属于基因工程技术。本发明专利技术载体上连接有突变的ｐ５３外显子８基因序列，并能够转录出与此突变点特异性结合的互补反义ＲＮＡ，从而阻断突变ｐ５３信号的表达；其制备方法是采用免疫组化筛选突变型ｐ５３细胞系、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法及基因测序确定突变的ｐ５３外显子和基因序列，把含有突变位点的ｐ５３外显子８序列插入ｐＧＥＭ３ｚｆ（＋／－）质粒载体的多克隆位点处，构建ｐＧＥＭ３ｚｆ（＋／－）ｐ５３ｅｘｏｎ８’重组载体。这样制备的反义ＲＮＡ被直接导入研究细胞内，因为是直接导入反义ＲＮＡ本身，所导入的ＲＮＡ分子量小，较易进入细胞内，操作简单；由于体外转录系统能合成较多量的产物，可随时重复操作，满足需要的ＲＮＡ量。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术，更具体地说是一种。
技术介绍
研究己证实肿瘤是一种基因病，基因治疗是对癌发生的根本原因的治疗。p53属抑癌基因，与DNA损伤的修复、细胞周期调控、细胞凋亡及抑制肿瘤形成有密切的关系，因而有细胞内“分子警察”之美誉。p53基因突变是人类肿瘤最常见的分子生物学事件，大约50％人类肿瘤具有p53基因的突变，且几乎可见于各种类型的肿瘤细胞中。大量研究证实，突变型p53(mt-p53)不仅丧失野生型p53(wt-p53)所具有的抑癌功能，还具有与wt-p53形成异源寡聚体抑制wt-p53的功能，与p53家族成员p63、p73结合干扰它们的抑癌功能，实质上成了一种癌基因。另外还能使肿瘤细胞获得抵抗各种抗癌药物诱导凋亡的能力，使许多正在使用的抗癌药物疗效不理想。而且，有p53突变的肿瘤细胞生长旺盛，侵蚀性和转移率高，患者预后差，是一种不利的预兆因素。因此阻断mt-p53癌基因的表达成为抗癌研究的新领域。通过人工方法化学合成或在生物体内合成的反义核酸是与靶基因具有互补序列的DNA或RNA片段，通过碱基互补配对原理与特定靶基因或mRNA形成杂交链，从而阻断靶基因转录和翻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变型ｐ５３基因反义表达载体，其特征在于该载体上连接有突变的ｐ５３外显子８基因序列：ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ ＧＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴ；并由此载体能够转录出与此突变点特异性结合的互补反义ＲＮＡ，从而阻断突变ｐ５３信号的表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：付丽，许少峰，张斌，张媛媛，冯玉海，
申请(专利权)人：天津医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]