检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及其PCR扩增方法技术

一种改进的检测脊髓小脑共济失调ＡＴＸＮ３基因ＣＡＧ重复序列动态突变的引物及方法，其特点是采用专门设计的特殊引物，通过特殊的ＰＣＲ程序将ＡＴＸＮ３基因内含有ＣＡＧ重复序列的ＤＮＡ片段量扩增至凝胶电泳可观察的程度，利用凝胶电泳观察ＰＣＲ扩增产物片段大小并估算ＡＴＸＮ３基因中ＣＡＧ动态突变的重复次数。本发明专利技术的优点是：１．简单经济，不需测序，一般分子生物学实验室或检验室就可操作，从而建立了一个简便易行的扩增ＣＡＧ重复序列的检测方法。２．灵敏度及可靠性高，２５ｎｇ基因组ＤＮＡ就足够检测ＡＴＸＮ３基因中ＣＡＧ动态突变的重复次数，为临床诊断脊髓小脑共济失调提供可靠的依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域中的临床检测技术，具体涉及一种新的检测脊 髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及PCR扩增方 法，该检测结果可用于临床辅助诊断脊髓小脑共济失调。
技术介绍
脊髓小脑共济失调(SpinocerebellerAtaxia, SCA)是一组以进行性平銜-和协调障碍为特点的中枢神经系统慢性退行性疾病，以前曾被称为常染色体显性共济失调(Autosomal Dominant Cerebellar Ataxias, ADC As )。脊ft小脑 共济失调的主要病变部位在脊髓、小脑和脑干，其他组织如脊神经、脑神经、 交感神经、基底节、丘脑、丘脑下部和大脑皮质均可受累，还可伴有其他系 统异常，如骨骼畸形，眼部病症，前庭及听力障碍，心脏、内分泌及皮肤病 变等。由于病变部位多样化及损害程度轻重不等，故症状复杂，临床和病理 分类也甚混乱。1983年英国神经病学家Harding按神经病理标准分类将 ADCAs分为3种类型I型除小脑共济失调外还包括眼球运动障碍、慢眼运 动、视神经萎缩、锥体束征、肌萎缩、周围神经病和痴呆；II型以小脑共济 失调伴视网膜色素变性为特征；III型为单纯小脑共济失调。随分子生物学技术的发展，1993年SCA的第一个亚型SCA1的易感基 因被定位克隆，随后许多SCA的致病基因被识别出来，于是按照各亚型发现 的先后顺序依次命名为SCA1 ~ SCA27等，这种分子遗传学分类已经成为国 际上惯用的分类方法。SCA具有遗传异质性，其最具特征的基因缺陷是编码 多聚谷氨酰胺的CAG三核苷酸重复序列的延长，这导致相关蛋白的构象变 化并在神经元内形成聚集体，最终导致神经元的缺失。其他突变类型包括 CTG三核苷酸(SCA8)、 ATTCT五核苷酸(SCA10)重复序列扩增以及某 些基因的点突变。由CAG重复序列异常扩增引起的SCA的症状往往与CAG 重复序列的大小有关， 一般而言，重复次数越大，病情愈重。临床上通常根据共济失调、构音障碍、锥体束征等典型共同症状，以及 伴眼肌麻痹、锥体外系症状及视网膜色素变性等表现，结合MRI检查发现小 脑、脑干萎缩，排除其他累及小脑和脑干变性病可进行初步诊断。然而，仅 才艮据各亚型特征性症状、体征确诊仍不准确(SCA7除夕卜)，最终确诊需要进 行基因诊断，具体是检测相应基因内CAG的重复次数，以准确判定亚型。SCA3又称为约瑟夫氏病(MJD)，是我国最常见的SCA亚型，相关基 因ATXN3位于14q24.3-q32.2，编码960个氨基酸残基组成ataxin-3蛋白。 CAG重复序列位于4号外显子，正常人的重复次数在12-41之间，而患者 的重复次数为61 - 89。于是可以通过PCR方法一全测CAG重复序列的大小来 判断该基因是否突变。然而，该基因内CAG重复序列的GC含量高达67。/。， 极大地增加了该序列PCR扩增的难度。现有4支术釆用序列表SEQ ID No. 1中 所示的正向引物碱基序列和序列表SEQ ID No.2中所示的反向引物石成基序列 作为一对引物进行PCR扩增，得到的结果如附图1的左侧所示，特异性不高。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物及其 PCR扩增方法，目的是解决现有PCR扩增ATXN3基因CAG重复序列特异性 不高的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是一种检测ATXN3基因CAG 重复序列动态突变的引物，采用以下一对引物(5，一3，) 正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG; 反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG。 为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 一种检测ATXN3基因CAG 重复序列动态突变的PCR扩增方法，(1) PCR扩增采用以下一对引物(5，一3，) 正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG; 反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG;(2) PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成 第一阶段由30-40次扩增循环构成，其条件为 变性温度为94°C ~98°C;退火起始温度为70。C,每两次扩增循环温度递减rC,直至扩增循环 结束；延伸温度为68°C ~72°C;第二阶段由10-20次扩增循环构成，其条件为变性温度为94°C ~98°C;退火温度为53°C ~55°C;延伸温度为68°C ~72°C。上述技术方案中的有关内容解释如下41、 上述方案中，PCR (polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增 DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只 要有一个拷贝的待扩增DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异 性DNA片段。该方法广泛应用于基因斥企测。PCR扩增的基本原理是模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互 补链聚合反应为基础，通过把DNA变性、引物与模板DNA (待扩增DNA ) 一侧的互补序列退火复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循 环，产生待扩增的特异性DNA片段。 一般反应过程是1、将反应体系加热 至90 98。C，模板双链DNA变性成为两条单链DNA,作为互补链聚合反应的 模板；2、降温至37 6(TC,使两种引物分别与模板DNA链的互补序列退火复 性；3、升温至70 75。C，在耐热性DNA聚合酶催化下，四种脱氧核糖核酸按 与模板碱基配对原则沿引物5， —3'方向延伸，合成模板DNA链的互补链。重 复以上过程，就可以出现待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的 两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA 的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，理论上，待扩增的特异性DNA 片段可达到2n个拷贝数。2、 上述方案中，在PCR扩增的第一阶段，退火温度第一和第二扩增循环为70。c,第三和第四扩增循环69。c，每两次递减rc,以此类推。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点和效果1、 本专利技术采用特殊设计的引物，其PCR产物特异性非常高。利用该基因 ;险测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来 判断脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态突变情况。2、 本专利技术采用特殊的PCR程序，PCR效率和灵敏度高，可以检测微量 DDNA样本中脊髓小脑共济失调ATXN3基因中CAG重复序列动态突变，为 临床诊断脊髓小脑共济失调提供可靠的依据。3、 本专利技术经济，不需测序。4、 本专利技术操作简单， 一般分子生物学实验室或^r验室就可操作。5、 本专利技术建立了一个的简便易行的扩增CAG重复序列的PCR方法，为 提高生物样本临床检测水平，及其推广应用奠定基础。附图说明附图1为采用现有引物和本专利技术的PCR扩增方法得到的DNA扩增体系凝 月交电泳图；5附图2为釆用本专利技术的《I物和现有PCR扩增方法得到的DNA扩增体系凝 胶电泳图；附图3为釆用本专利技术的引物和本专利技术的PCR扩增方法得到的DNA扩增体 系凝胶电泳图；附图4为CAG重复序列测序结果。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述实施例一 一种检测脊髓小脑共济失调ATXN3基因CAG重复序列动态 突变的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ＡＴＸＮ３基因ＣＡＧ重复序列动态突变的引物，其特征在于：采用以下一对引物（５’→３’）：　正向引物：ＣＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＴＴＣＧ；　反向引物：ＣＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧ。

【技术特征摘要】
1、一种检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的引物，其特征在于采用以下一对引物(5’→3’)正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG；反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG。2、 一种检测ATXN3基因CAG重复序列动态突变的PCR扩增方法，其 特征在于(1) PCR扩增采用以下一对引物(5，一3，) 正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG; 反向引物CATGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦正红，方琪，何晓辉，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[]