本发明专利技术涉及一组用于检测HBV基因突变的核苷酸序列，其具有SEQ?ID?NO：1-15所示的核苷酸序列中的至少一种。本发明专利技术还提供了利用该序列在检测HBV基因突变时的应用，使用本发明专利技术可对HBV的10个常见基因突变位点进行检测。使用本发明专利技术检测HBV基因突变时，具有通量高、灵敏度高、特异性好的优点，而且检测成本低，具有实际临床推广和应用的价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒基因检测领域，具体涉及一组用于检测HBV基因突变的核苷酸序 列及其应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒科 (hepadnaviridae)，基因组长约3. 2kb,是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部 分重叠的开放读框，即前-S/S区、前-C/C区、P区和X区。同一患者体内不同的HBV株基 因序列之间可能存在差别，但在遗传学上却高度相关。研究表明，每个患者体内的病毒都是 由存在基因序列差异的病毒株组成的病毒群，优势群和劣势群是相对的，并始终处在不断 的变化之中。HBV的复制速度很快，据推算，HBV每M小时可复制IO12 IO13拷贝。HBV基 因组有3200个碱基对，聚合酶错配率为10_4至10_5/碱基/循环，因此每天每个碱基都可能 发生变化，其突变率约为其他DNA病毒的10倍。研究证实，HBV在逆转录复制过程中所需 的RNA聚合酶和逆转录酶缺乏严格的校正功能，使得HBV基因组自身变异率较高。由于HBV基因的这种高突变率，导致了其对于核苷酸类似物药物容易出现耐药 性。常见的抗核苷类药物，主要包括拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和 替比夫定(LdT)。经过常年使用这些核苷酸类似物药物，大多数病人体内的HBV病毒已经出 现了各种各样的突变，这些突变导致了病人对上述核苷类药物出现耐药性。如果不能及时 发现这些突变，就不能及时更换药物种类，从而延误病人的病情，同时也增加了病人的经济 负担。因此对于这些病人体内HBV基因突变的情况进行检测是一个临床上急需解决的问题。目前，国内外对HBV基因突变的检测方法主要有以下几种(1)测序法测序法能够检测整个HBV序列中几乎所有可能的突变，一度被视为突 变检测的金标准。但测序反应对于少量耐药突变株的检测并不敏感。当耐药株低于50% 时，随着耐药毒株比例的下降，基因测序的假阴性率迅猛增高，因此这种方法很容易忽略小 于准种20%的低丰度耐药株突变。(2)限制性片段长度多态性分析(RFLP)首先对每个已知的耐药位点设计野生型 和耐药型的特异性核酸内切酶识别位点，经PCR和酶切后，根据酶切图谱来判断是否发生 耐药突变。虽然其检测灵敏度较高，但是由于每个检测位点均需要建立一个独立的酶切反 应体系，操作繁琐，况且并不是每个耐药位点都可以找到相应的酶切位点，因此技术难度 大，临床不宜推广。(3)线性探针分析法遵循反向杂交的原理，首先根据待测序列设计特异性探针并 固化在支持物上，对待测标本特定序列进行PCR扩增，然后将扩增产物与同相探针反向杂 交，显色得出结果。目前国外常采用比利公司生产的INNO-LiPA HBV耐药 突变试剂盒，当引起耐药的突变株只占总病毒数很小比例时，LiPA分析就能检测到，因此在 疾病进展处于高风险时该方法有优势。但是其价格昂贵，20条检测试纸条进口价格为1万 元，国内现仅限于实验研究用。(4) TaqMan技术PCR技术作为一种快速诊断技术，具有特异性高、灵敏度高、操作 简便且价格较便宜等优点。使用常规TaqMan技术进行HBV耐药基因检测设计，对于两种突 变的位置相隔很近(中间只隔1个碱基)耐药位点，不利于设计引物，同时，需合成较多简 并引物以提高检出率，成本较高，反应体系也很难稳定，并且与其他技术一样无法对病毒的 共生关系进行准确判断。(5)基因芯片该技术是近年兴起的一项技术，在高通量等方面有着其他技术无与 伦比的优势，但重复性差、易污染、操作复杂的缺点及其昂贵的价格也使这项技术的推广受 到严重制约，特别是对于突变位点不多的HBV耐药基因的检测。(6)熔点曲线法该法是利用特异性探针与靶序列结合，分析Tm值改变的原理进 行突变。它具有很多TaqMan技术的优势，包括操作简便、成本低廉、灵敏度高等特点，但熔 点曲线法有个显著的特点，就是特异性差，也就是说熔点曲线法无法正确区分待检基因突 变和临近位点突变，该技术只能应用在附近区域非常保守的突变检测。另外，针对HBV耐药 毒株与敏感毒株共存问题，熔点曲线也无法对敏感株和耐药株的比例关系进行准确鉴别， 在临床上很难正确指导用药。(7)质谱法这种方法也是近年来新出现的一种检测方法，具有检测成本低、灵敏 度高的特点，通常能检测突变率超过5%的HBV耐药突变株，因此有广阔的临床应用前景。 但如何在质谱平台上实现通过单次检测即可获得多种HBV基因突变位点信息的技术还不 够成熟，关键是HBV基因突变位点附近核苷酸引物设计方面存在难度，从而制约了这种检 测技术的推广。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一组用于检测HBV基因突变的核苷酸序列，并提供上述核苷 酸序列在检测HBV基因突变过程中的应用，旨在解决现有HBV基因突变位点检测方法灵敏 度低、效率低且成本较高的问题。本专利技术所提供的--组用于检测HBV基因突变的核苷酸序列，其序列如下SEQIDNO1 5，-acgttggatggtaccccaacttccaattac-3，；SEQIDNO2 5，-acgttggatgacgattcctgctcaaggaac-3，；SEQIDNO3 5，-ccactgtttggctttca-3'；SEQIDNO4 5，-gttcagtggttcgtagg-3‘；SEQIDNO5 5，-acgtttggttttattaggg-3'；SEQIDNO6 5，-cactgaacaaatggcactag-3‘；SEQIDNO7 5，-gcctcagtccgtttctc-3'；SEQIDNO8 5，-actgaacaaatggcacta-3‘；SEQIDNO9 5，-accccaataccacatcatc~3f ；SEQIDNO10 5’ -acttccaattacatatccca-S'；SEQIDNO11 5’ -catcctgggctttcgcaaga-3'；SEQIDNO12 5’ -tcagtccgtttctcctg-3'；SEQIDNO13 5，-aaacggactgaggccca-3‘；SEQIDNO14 5，-atggcactagtaaactga-3‘；SEQ ID NO 15 5' -actgtttggctttcagctat-3‘；在本专利技术的一个优选实施方案中，通过SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2组合，可以用 于扩增HBV基因组RT区域的核苷酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，通过使用SEQ ID NO :3-15所示的核苷酸序列作 为延伸引物，可在质谱平台上用于检测HBV基因突变。 在本专利技术的一个优选实施方案中，使用本专利技术的核苷酸序列，可以检测的HBV基 因突变为 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、 rtM204V、rtM204I、rtN236T 和 rtM250V 中的一种或几种。因此，使用本专利技术的核苷酸序列可以在质谱平台上实现单次检测获得多个HBV基 因突变位点信息，从而大大提高了检测效率，降低了检测成本，为临床诊断乙肝病人的耐药 性，进而指导临床医生调整用药方案提供了极大帮助。附图说明图1为本专利技术实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一组用于检测ＨＢＶ基因突变的核苷酸序列，其特征在于具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１５所示的核苷酸序列中的一种或几种：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５’－ａｃｇｔｔｇｇａｔｇｇｔａｃｃｃｃａａｃｔｔｃｃａａｔｔａｃ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５’－ａｃｇｔｔｇｇａｔｇａｃｇａｔｔｃｃｔｇｃｔｃａａｇｇａａｃ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５’－ｃｃａｃｔｇｔｔｔｇｇｃｔｔｔｃａ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５’－ｇｔｔｃａｇｔｇｇｔｔｃｇｔａｇｇ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５’－ａｃｇｔｔｔｇｇｔｔｔｔａｔｔａｇｇｇ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５’－ｃａｃｔｇａａｃａａａｔｇｇｃａｃｔａｇ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５’－ｇｃｃｔｃａｇｔｃｃｇｔｔｔｃｔｃ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５’－ａｃｔｇａａｃａａａｔｇｇｃａｃｔａ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５’－ａｃｃｃｃａａｔａｃｃａｃａｔｃａｔｃ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５’－ａｃｔｔｃｃａａｔｔａｃａｔａｔｃｃｃａ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５’－ｃａｔｃｃｔｇｇｇｃｔｔｔｃｇｃａａｇａ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５’－ｔｃａｇｔｃｃｇｔｔｔｃｔｃｃｔｇ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５’－ａａａｃｇｇａｃｔｇａｇｇｃｃｃａ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５’－ａｔｇｇｃａｃｔａｇｔａａａｃｔｇａ－３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５’－ａｃｔｇｔｔｔｇｇｃｔｔｔｃａｇｃｔａｔ－３’；...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张宇清，刘海龙，应康，李建和，
申请(专利权)人：上海邃志生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。