本发明专利技术公开了一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针为序列表中SEQIDNo：1-No：75所示的序列。本发明专利技术所述基因芯片可用于简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测
，具体涉及一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HIV)具有高度的基因变异性，根据其基因序列的差异，将其分 为HIV-I型和HIV-2型。目前世界范围内流行的主要为HIV-I型。HIV-I又进一步分为3 个组M组、0组和N组。M组内又可分为A-D，F-H和J、K9个基因亚型，另外还有；34个以上 流行重组型(CRF)。到目前为止，我国的感染者中已经确定了 A、B’、B、C、D、B/C (CRF07-BC、 CRF08-BC)、CRFOl-AE和CRF02-AG 8种亚型。HIV的基因分型最初是依据膜区(env)的 基因序列分析确定的，后来gag区也作为HIV分型的依据。随着更多HIV基因序列的获 得，人们发现依据某个片段进行的基因分型往往并不准确，例如最先人们根据HIV env区的 gpl20和gp41的基因序列确定了 E亚型，后来对其gag区和pol区的序列分析发现其属于 A亚型，因此，将其重新定义为重组亚型CRF01-AE。随着近些年HIV各种重组类型的不断增 多，这种依据部分片段的基因序列进行亚型鉴定的方法越来越受到局限性。依据最新的HIV 分类和命名原则，要确定新的亚型必须进行全基因序列分析。HIV基因亚型的检测的最经典方法是基因测序分析，该方法存在以下明显局限性 (1)技术难度大，要求高该方法中无论是基因扩增、基因测序还是生物信息学分析，需要非 常专业的高端技术人员才能完成，只有在少数高端实验室才能完成。(2)设备昂贵，检测周 期长，基因测序仪一般都在200万元以上，一个完整的分析周期至少得两周左右。(3)很难 进行全基因序列分析由于测序费用的昂贵和周期问题，一般都采用测定部分基因片段对 HIV进行亚型分析，如前所述，这种来自于部分信息的分析往往会不完全准确。基因芯片(genechip)也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)，是20世纪 90年代发展起来的技术，其主要原理是在玻片等固相载体上以微点阵的形式固定各种基 因探针，组成二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过激光共聚 焦荧光检测系统对芯片进行扫描，对每一个探针上的荧光信号进行检测，从而应用核酸 杂交的原理来检测待检样品中的目的基因。该方法具有操作简单，自动化程度高，高通量等 特点，检测靶分子种类多、效率高、结果客观性强，基因芯片技术可实现对生物样品快速，高 通量地进行检测和医学诊断。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因 芯片及含有该基因芯片的试剂盒。所述基因芯片是以HIV全基因序列分析为基础，可用于 简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的序列。所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。本专利技术还保护基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片在确定HIV基因亚型中 的应用。本专利技术还保护一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交试剂盒，该试剂盒包括 上述基因芯片，即该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中， 所述寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列。所述试剂盒还包括PCR扩增引物，所述引物为为序列表中SEQ ID No 76^ No 87 所示的核苷酸序列。所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、PCR产物纯化柱、标记物、杂交液、洗涤液，其中， 所述标记物为荧光素Cy5-dCTP。另外，本专利技术还提供了一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法。该 方法包括以下步骤(1)制备待测样品的cDNA;(2)设计并制备出PCR扩增引物；所述引物为序列表中SEQID No: 76 No: 87所示 的核苷酸序列；(3)使用步骤(2)中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤(1)中所述cDNA进行PCR扩增；(4)纯化上述扩增产物；(5)标记纯化的扩增产物使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物和荧光素Cy5-dCTP进 行标记；(6)将标记产物与上述基因芯片杂交、洗涤；(7)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。进一步地，在所述步骤(3)中，使用步骤(2)中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤 (1)中所述cDNA分三段分别进行二轮PCR扩增。进一步地，在所述步骤(5 )中，使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物分三段和荧光 素Cy5-dCTP进行标记；进一步地，在所述步骤(6)中，杂交温度为40°C，杂交时间为16h。本专利技术的有益效果通过对待检样品的扩增和标记，利用本专利技术的基因芯片可以 直接对HIV的基因亚型进行判断。无需复杂的专业分析，具有简单、快捷，成本低等优点，并 且，本专利技术中芯片使用的探针是针对HIV全基因组设计，这样对HIV分型的结果就更加准确 禾口可靠°附图说明图1基因芯片杂交后的扫描结果图(07BC)； 图2基因芯片杂交后的扫描结果图(B)；图3基因芯片杂交后的扫描结果图(01AE)。具体实施例方式CN 102140553 A说明书3/8页下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但这些实施例仅限于说明本专利技术而不用于 限制本专利技术的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1寡核苷酸探针的制备 1.探针的设计根据国际HIV数据库http //www. hiv. lanl. gov得到各种基因亚型的HIV参考全基因 序列，使用ClustalX 1. 83基因序列进行比对，找出靶基因中的种内保守区和种间特异区， 然后再使用I^rimer premier 5. 0软件在此区设计探针。探针序列如表1。探针的设计应 遵循以下原则(1)探针之间的Tm值相差不要超过5°C，探针长度为不超过25个碱基；(2) 探针的G+C含量在40-60%之间；(3)避免有5个以上重复碱基。表1探针序列SEQID探针编号亚型序列(5’-3’)No10A-34680GGTCCAATGGCCTGGTACAGCATGGNo20A-34690GGCTTTGATAACCCCATGTTTGAGCNo3OA-34700ATGCATCATAGGGACCTGCTAGCAANo4OA-34710AGTAATGGGGAGCAGGAAGTCTGCGNo5OA-3472NAGGAACTATTCAGGTGTCATTTTTGNo6OA-3473NAGTAAAAGCTGTATATATGCTGGAGNo7OA-3474NCACAGCCTGGGTGGGAGTAAAGAANo8OA-3475NTCTTAGGGAGACCAGTATTCCCTAGNo9OA-3476NGAAAGTGGTCTCTATTGMGACACCNo10OA-347731BCATAAACTTTACAAAGCACTCAGGAGNo11OA-347808BCMCGCTGTAGCTACCATTGTCTAGTNo12OA-347908BCGTAATGTTAGATTTAGAATT本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于全基因组探针的ＨＩＶ亚型检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于，该寡核苷酸探针为序列表中ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １－ Ｎｏ： ７５所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建礼，朱红，张绍福，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：11
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