一种快速构建基因打靶重组用载体的方法技术

本发明专利技术公开了一种借助于Ｇａｔｅｗａｙ克隆系统的快速构建基因打靶重组用载体的方法。首先，它用特殊设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增，得到用于同源重组的５’和３’同源臂，通过ＢＰ重组反应分别装入ｐＤＯＮＲＰ４－Ｐ１Ｒ和ｐＤＯＮＲＰ２Ｒ－Ｐ３载体中；然后，将目的片段装入我们创造性构建的中间载体ｐＤＯＮＲ　　ｌｏｘＰ／ＭＣＳ／ｌｏｘＰ－ＦＲＴ／ＮＥＯ／ＦＲＴ中；最后，将以上３种载体与ｐＤＥＳＴ　　Ｒ４－Ｒ３ＴＫ载体的混合物在通过１小时快速ＬＲ重组反应后，５’同源臂，中间片段，３’同源臂，以及ＴＫ负筛选元件便会自动按照设计的顺序拼接，转化并纯化后即得到基因打靶用载体。该方法具有快速、灵活、省时、省力等优点，并突破了传统方法中内切酶位点分布的限制，在基因功能研究方面有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种快速构建基因打靶重组用载体的方法，其特征在于该方法的步骤为：Ａ．５’和３’同源臂载体的构建：利用特殊设计的ＰＣＲ引物，以基因组ＤＮＡ为模板，用ＬＡＴａｑ酶扩增用于同源重组的５’和３’同源臂片段，目的ＰＣＲ片段通过琼脂糖凝胶分 离并切胶回收后，分别与１００－２００ｎｇｐＤＯＮＲＰ４－Ｐ１Ｒ或ｐＤＯＮＲＰ２Ｒ－Ｐ３载体混合，在ＢＰＣｌｏｎａｓｅⅡ酶切混合物的作用下进行Ｇａｔｅｗａｙ同源重组反应，３７℃保温１小时后转化至ＤＨ５α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的Ｌ Ｂ固体培养基上进行筛选培养，序列的正确性用Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ引物正反测序验证，装配好的载体我们分别命名为ｐＥＮＴＲ５’和ｐＥＮＴＲ３’；Ｂ．中间载体的构建：根据不同的实验要求，对我们构建的质粒载体ｐＤＯＮＲｌｏｘＰ／ＭＣＳ／ｌｏｘＰ －ＦＲＴ／ＮＥＯ／ＦＲＴ进行改造，（１）常规基因敲除：不必做任何改造；（２）条件基因敲除或基因插入：将需要敲除或插入的片段用限制性内切酶消化，然后用Ｔ４连接酶连接至ｐＤＯＮＲｌｏｘＰ／ＭＣＳ／ｌｏｘＰ－ＦＲＴ／ＮＥＯ／ＦＲＴ载体中位于两个ｌｏｘＰ位点之间的多克隆位点即ＭＣＳ，将连接产物转化至ＤＨ５α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的ＬＢ固体培养基上进行筛选培养；Ｃ．最终载体的拼装：将以上３种载体与ｐＤＥＳＴ－Ｒ４Ｒ３－ＴＫ载体各６０－１００ｎｇ混合，加入ＬＲＣｌｏｎａｓｅ Ｐｌｕｓ酶切混合物进行Ｇａｔｅｗａｙ同源重组反应，３７℃保温１小时后转化至ＤＨ５α大肠杆菌后于氨苄青霉素抗性的ＬＢ固体培养基上进行筛选培养，对长出来的克隆进行扩增、纯化即可得到最终的重组载体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔冬，高翔，王鹏飞，章念，郑斌，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]