一种宽pH作用范围木聚糖酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种宽pH作用范围木聚糖酶XynA（EC?3.2.1.8)及其应用，属于酶工程和基因工程领域。该木聚糖酶XynA来源于Streptomyces?sp.HJ，其最适pH5.5，pH稳定范围3～11；最适温度60℃，50℃半衰期为30h；Km和Vmax分别为3.45mg/mL，845.23μmol/min/mg。其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1，成熟蛋白436个氨基酸残基。重组XynA在E.coli?BL21(DE3)中表达胞外酶活为213.5U/mL，是野生菌Streptomyces?sp.HJ酶活的11倍。XynA有较宽的pH作用范围，尤其在碱性环境下，其可能在竹原纤维生物酶脱胶、纸浆漂白等行业具有潜在利用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种木聚糖酶及其应用，特别是一种宽pH作用范围的木聚糖酶，属于酶工程和基因工程领域。
技术介绍
木聚糖(Xylan) (EC 3. 2. I. 8)是植物细胞壁半纤维素组分的主要成分，占植物碳水化合物总量的三分之一。在自然界中，木聚糖是继纤维素之后含量最为丰富的多聚糖。木聚糖的主链由多个毗喃木糖基通过β_1，4-糖苷键连结形成，侧链含多种不同取代基。木聚糖酶属于0-glycoside hydrolases(EC 3. 2. I. x),可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖单糖。它是一种复合酶，主要包括 endo-β-I, 4-xylanase (EC 3· 2· I. 8)和 β-xylosidase (EC3. 2. I. 37)。前者从主链内部随机作用于β -I, 4-糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖；后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖单糖。目前已经发现的endo- β -I, 4-xylanase主要分布在5、7、8、10、11、43等家族的糖苷水解酶中，其中大部分属于GH familylO和11两大家族。GH familylO木聚糖酶通常含有两个结构域，包括催化结构域和纤维素结合结构域(Cellulose Binding Domain:CBD), 相对分子质量一般大于30kDa，在结构上呈现“桶状”;而GH familyll木聚糖酶多为单结构域，只含有催化结构域，相对分子质量一般小于30kDa，在空间结构上呈“右手半握状”。迄今，已经有一些关于放线菌来源的木聚糖酶的报道，其中大部分为链霉菌， 如 Streptomyces sp. SffUlO, S. thermotrificans, S. lividans, S. olivaceoviridis E-68等等。现今一些来源于链霉菌的木聚糖酶在pH 10.0时已经没有酶活，如来源于 Streptomyces sp.S9 的 XynAS9, Streptomyces sp. strain AMT-3 的 xylanase, Streptomyces sp. S2 7 的 xylanase, Streptomyces sp. SffUlO 的 XynSW2A/B ;而来源于 Streptomyces megaspores DSM 41476 的一个拥有宽 pH 的木聚糖酶 XYNAM6 在 ρΗ10· O 和11.O的残留酶活也只有38%和15%。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题在于提供一种宽pH作用范围稳定性的木聚糖酶，所述其氨基酸序列如以下I)或2)或3)所示I)其氨基酸序列为SEQ ID NO. I所示序列；2)在I)限定的氨基酸序列的基础上氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列；3)与I)或2)限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。所述木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的木聚糖酶的宽pH作用范围是指pH 4. 5 10. O。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供了一株含木聚糖酶的基因工程菌。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供了一种木聚糖酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤I)设计引物克隆木聚糖酶的基因xynA ；2).将基因克隆到重组表达载体上；3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。所述重组表达载体为pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一种。所述重组表达载体为pET_20b。所述宿主细胞为为细菌，酵母或真菌。所述细菌为E. coli BL21(DE3)、E. coli W3110、Ε· coli JM109、E. coli JM109(DE3)、Ε· coli DH5 α 中任意一种。本专利技术所述的木聚糖酶XynA的最适ρΗ5. 5,最适温度60°C;有较宽的pH作用范围， 尤其在碱性环境下pH4. 5 10. O范围内相对酶活均在50%以上，pHll. O时仍有41%的酶活，比木聚糖酶XYNAM6的在碱性范围内残余酶活高；pH稳定范围在3 11之间，残余酶活力均在80%以上。重组XynA基因工程菌表达胞外酶活为213. 5U/mL,是野生菌Sti^ptomyces sp. HJ酶活的11倍。因此，在竹原纤维生物酶脱胶、纸浆漂白、食品等行业具有潜在利用价值。附图说明 图I纯化所得XynA的SDS-PAGE图。I、标准蛋白分子量；2、纯化后样品(XynA)。图2 XynA的最适pH及pH稳定性曲线图。图3 XynA的最适温度及温度稳定性曲线图。图4重组XynA的发酵过程图。■:大肠杆菌OD6tltl曲线；O :重组XynA的酶活曲线。图5 重组 XynA 的 SDS-PAGE 图。I、标准蛋白分子量；2、重组 XynA。具体实施方式实施例I :菌种的筛选和鉴定采用的竹块为一年生毛竹，将竹材沿纵向截成50cm左右的长段，洗净后浸入怄竹液中，室温发酵一段时间。将Iml怄竹液在IOOml含木聚糖5g/L、(NH4)2SO4 O. 5g/L、酵母浸出液 O. 5g/L、MgSO4 · 7H20 O. 3g/L、K2SO4 O. lg/L、KH2PO4 I. Og/L、CaCl2 · 2H20 0. 2g/L、 微量元素溶液0. 5ml的培养基中37°C富集培养24h。然后将富集培养液以梯度稀释的方法接种到含上述培养基成分的琼脂培养皿中。在37°C培养2-4天后，挑单菌落至选择培养基 (竹粉 20g/L、(NH4)2SO4 2. 5g/L、K2HPO4 O. 5/L、MgSO4 lg/L、琼脂 20g/L)。在上述两种培养基平板上都可以生长的菌落被选出进行发酵培养，选出可产木聚糖酶的优势菌株。对选出的优势菌株进行16S ribosomal DNA鉴定,鉴定结果显不有一株优势菌株与Streptomyces viridochromogenes (FJ790787)同源性达 99%,因此可确定为 Streptomyces species。将该产木聚糖酶的链霉菌命名为Streptomyces sp. HJ,并保藏。实施例2 Streptomyces sp. HJ的发酵及XynA的纯化在含蛋白胨1%、酵母浸出液O. 5%、牛肉膏O. l%、NaCl O. 5%的种子培养基中接入一定量的Str印tomyces sp. HJ, 30°C, 200 rpm摇床培养24h后接含麸皮3%、蛋白胨O. 3%、酵母浸出液 O. 3%,KNO3 1%>KH2PO4 O. 05%、Na2HPO4 ·12H20 O. 05%、无水 MgSO4 O. 05%、Tween800. 1% 的发酵培养基，同样条件培养3 4d后，离心收集上清即为粗酶液，酶活达到19U/mL。通过硫酸铵分级沉淀的方法确定40%(w/v)硫酸铵恰好使XynA完全盐析。因此, 将发酵液上清缓慢加入40%(w/v)硫酸铵盐析过夜，12，OOOXg, 40C，离心30min ;用适量缓冲液A (20mM醋酸-醋酸钠，pH5. 0)将沉淀溶解，4°C透析过夜、膜过滤(0. 45 μ m)后即为上样样品。SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种宽pH作用范围木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如以下1）或2）或3）所示：1）其氨基酸序列为SEQ?ID?NO.1所示序列；2）在1）限定的氨基酸序列的基础上氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列；3）与1）或2）限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种宽PH作用范围木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如以下I)或2)或3)所示 I)其氨基酸序列为SEQ ID NO. I所示序列； 2 )在I)限定的氨基酸序列的基础上氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列； 3)与I)或2)限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。2.编码权利要求I所述木聚糖酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。3.含有权利要求I或2所述木聚糖酶的基因工程菌。4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤 1)设计引物克隆木聚糖酶的基因xyn...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，陈晟，何洁，宿玲恰，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：